發酵液中金褐霉素提取工藝的優化及鑒定

魏 杰， 金 爽， 孟憲軍， 王秋雨

（1.遼寧大學 生命科學院，遼寧 沈陽 110036；2.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110161）

金褐霉素（Aureofuscin）是鏈霉菌新種—金褐鏈霉菌（Streptomyces aureofuscus.n.sp）產生的一種四烯大環內酯類抗真菌抗生素，其化學結構與國外文獻報道的納他霉素（Natamycin）結構相似。早期研究表明，金褐霉素對霉菌、多種酵母菌及絲狀真菌有很強的抗菌作用，但不抗細菌，臨床上用于治療真菌性角膜炎，其療效優于兩性霉素B，同時對一些真菌引起的皮膚病及霉菌性陰道炎等也有很好療效。金褐霉素早在1975年發現時只做了早期化學結構和初步藥效試驗后，一直未作深入研究和進行產業化開發[1-3]。在1997年我國正式批準使用納他霉素作為安全食品防腐劑后，金褐霉素才被重新重視起來。由于未作高產菌種選育和分離提取工藝的深入研究，發酵單位和提取收率都不高，難以達到產業化開發要求[4-6]。鑒于金褐霉素與納他霉素有著相似的化學結構和生物活性，而納他霉素現在主要依賴進口，因此金褐霉素的研究開發在真菌疾病的防治和食品防腐上顯示出了極好的應用前景和市場潛力，這對促進新藥研制、食品防腐和發酵工業的發展都具有積極意義。

目前關于金褐霉素提取和檢測方面的研究報道很少。本研究是在項目組前期研究工作基礎上，采用大孔吸附樹脂從發酵液中分離提取金褐霉素，篩選出較優的金褐霉素吸附劑，然后確定金褐霉素提取純化的最適工藝條件；并對所得提取物樣品采用紅外光譜、核磁共振進行檢測分析，鑒定金褐霉素的結構及其理化性質，同時進一步驗證提取工藝的效果。

1 材料與方法

1.1 菌種

金褐鏈霉菌 （Streptomyces aureofuscus.n.sp）由沈陽農業大學食品學院實驗室保存菌種。

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基（組分g/dL） 葡萄糖2，玉米淀粉 1.5，黃豆粉 1，蛋白胨 0.3，玉米漿 1，酵母粉 1，MgSO4·7H2O 0.05，NaCl 0.4，CaCO30.6；pH 自然[7]。

1.2.2 發酵培養基（組分g/dL） 葡萄糖4，玉米淀粉 2， 蛋 白 胨 0.3， 黃 豆 粉 1，MgSO4·7H2O 0.05，CaCO30.6[8]。

1.3 搖瓶發酵實驗

將斜面活化好的菌種用挖塊法接種于裝有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，220 r/min搖床培養，29℃培養40 h，使菌體處于迅速生長期。然后以體積分數10%接種種子液到裝液量為50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，29℃、220 r/min搖床發酵72 h。

1.4 金褐霉素提取工藝優化

1.4.1 金褐霉素提取工藝路線

1.4.2 樹脂的篩選 樹脂的吸附率和解吸率是衡量樹脂的重要指標，不僅吸附量大，還要求解吸率高，以保證成分最大限度地回收。作者選用8種大孔吸附樹脂（X-5大孔吸附樹脂；HPD100、HPD400、HPD600、HPD200A、AB-8 大孔吸附樹脂；D101 大孔吸附樹脂、WD-6大孔陰樹脂）進行靜態吸附試驗和甲醇解吸試驗，比較它們的吸附率和解吸率，從中選擇出最適合的樹脂作為試驗采用的處理樹脂。

1.4.3 樹脂的吸附和解吸 準確稱取1 g濕樹脂于錐形瓶中，加20 mL金褐霉素發酵粗提液，封口，避光置于搖床中，在18℃、100 r/min的條件下振蕩吸附一段時間，將上述吸附飽和的大孔樹脂用水洗至流出液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，加入一定量甲醇，在相同的條件下振蕩解吸一段時間，收集解吸液，蒸發到體積為20 mL[9-11]。分別測吸附前、后溶液中金褐霉素濃度按下列方程計算:

式中，Q為吸附率 （%）；c0為吸附前質量濃度（mg/mL）；c1為吸附后質量濃度 （mg/mL）；c2為解吸后質量濃度（mg/mL）；D 為解吸率（%）。

1.5 金褐霉素含量的測定

取發酵液 （總體積6.0 L）1 mL，加入9 mL甲醇，充分振蕩后離心（3 000 r/min，20 min）除去菌絲體的不溶物，取1 mL上清液用甲醇進行10倍數的稀釋后，高速離心（10 000 r/min，10 min），所得上清液即為HPLC待測液。

1.5.1 高效液相色譜法（HPLC） 流動相為甲醇∶水∶冰醋酸 （體積比 60∶40∶1）， 流速 1.0 mL/min， 進行HPLC等度洗脫，對金褐霉素進行定性定量檢測。

1.5.2 紫外光譜法 通過紫外分光光度計在波長200～400 nm內掃描，獲得金褐霉素最大吸收波長為302.5 nm，作為金褐霉素的檢測波長。

1.6 金褐霉素提取樣品的鑒定

1.6.1 紅外光譜分析法 將待測樣加入100 mg干燥的KBr，在4 000～400 cm-1范圍紅外掃描。本實驗提取樣品由沈陽農業大學生物中心檢測。

1.6.2 核磁共振分析法 將SCP-BI5 mg分別溶于0.5 mL D2O中，在600 M超導核磁共振儀上分別測其1H-NMR、13C-NMR譜及二維譜。本實驗提取樣品由北華大學生物測試中心檢測。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

大孔樹脂的吸附性能主要取決于吸附劑的表面性質，即樹脂的極性和空間結構。作者將金褐霉素提取液進行減壓濃縮，在溫度25℃、轉速100 r/min的條件下進行吸附和解吸，用100%甲醇進行洗脫，吸附和解吸時間均為24 h，實驗選取8種大孔吸附樹脂進行篩選，結果見表1。

表1 不同大孔樹脂對金褐霉素的吸附與解吸Table 1 Adsorptive and desorption rate of different macroporous adsorption resin for Aureofuscin

從表 1 可以看出，HPD400、X-5、WD-6、AB-8四種樹脂的吸附率較高，均可達到50%以上，X-5達78.7%；HPD100樹脂和X-5樹脂的解吸率較好，HPD100解吸率達93.5%，X-5達93.7%。吸附率和解吸率都是樹脂實驗考察的重要指標，在生產上不僅要求樹脂的吸附率大，還要求解吸率高，以保證有效成分最大限度回收。因此，綜合吸附率和解吸率兩個指標，選擇X-5型樹脂作為金褐霉素純化樹脂并進行后續實驗。

綜合本課題組前期實驗結果，金褐霉素提取工藝路線優化為:取金褐鏈霉菌發酵液3 000 r/min離心20 min，保留上清液。將含有菌絲體的不溶物用95%的乙醇浸提2次，合并浸提液，減壓濃縮至原發酵液體積的1/4，將濃縮液和保留的上清液充分混合，并調pH值至8.0。將混合液過X-5大孔吸附樹脂柱，80%乙醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮、抽濾得到黃色粉末，在甲醇中重結晶得到金褐霉素結晶物。

2.2 金褐霉素的紅外光譜分析鑒定

有機化合物的化學鍵或官能團都有各自的特征振動頻率，通過測定化合物的紅外吸收光譜，根據吸收帶的位置，推斷出分子中可能存在的化學鍵或官能團，再結合其它信息便可確定化合物的結構[12]。

圖1為提取樣品金褐霉素的紅外吸收光譜（KBr），結果顯示其在 3 372.77、1 743.65、1 654.55、2 927.33 cm-1等處均有典型吸收峰。3 500～3 300 cm-1區域內3 372.77 cm-1處的吸收峰是O—H，NH2的伸縮振動，表明存在分子間和分子內氫鍵；3 100～2 800 cm-1區域內 2 927.33 cm-1處的吸收峰是C=C的伸縮振動；1 800～1 500 cm-1區域內 1 743.65 cm-1處的吸收峰是C=O的非對稱伸縮振動；1 654.55 cm-1處的吸收峰是C=O對稱伸縮振動。綜上所述，所得到的目的產物是金褐霉素，它是大環內酯類的，同時也進一步證明本實驗提取樣品的工藝效果較好。

圖1 金褐霉素的紅外吸收光譜圖Fig.1 IR spectrum of Aureofuscin product

2.3 金褐霉素的核磁共振分析鑒定

天然化合物的結構鑒定是一項繁雜的工作，通常需要多種光譜學方法與化學方法相結合，才能確定物質的分子結構。X-衍射測定化合物的晶體結構是解析天然化合物結構最有效而且準確可靠的手段，但并非所有化合物都能夠得到完美的單晶樣品。因此，核磁共振技術仍然是確定天然化合物結構的最主要手段，體現了獨特的優勢。近20年來核磁共振技術的發展十分迅速，兩維核磁共振可用于分析原子之間的相關性，傅立葉變換技術提高了核磁共振的靈敏度、高頻超導核磁則提高了分辨率。核磁共振技術的發展對天然化合物的結構鑒定起到了極大的推動作用[13-15]。

作者采用核磁共振技術手段進一步確定其化學結構。金褐霉素產品的核磁共振碳譜和氫譜分別見圖2～3。譜圖中的化學位移與各碳原子、氫原子相對應。13C-NMR圖譜解析如下:圖中共有25個峰，對應于金褐霉素分子結構中的25個碳原子。由于相臨的兩個核之間的自旋偶合或自旋干擾，吸收峰發生裂分現象。因此，譜圖中不僅有單峰，還有二重峰、三重峰和四重峰。在δ48.450附近有一強吸收峰，對應于C*-NH2，而氫譜中δ4.906處出現的強吸收則對應N—H。通過金褐霉素和納他霉素的核磁共振譜和氫譜圖的對比，可以看出金褐霉素與納他霉素具有相似的化學結構，進一步證明我們得到的產物是金褐霉素。

圖2 金褐霉素產品的核磁共振碳譜圖（13C-NMR）Fig.2 13C-NMR spectrum of aureofuscin product

圖3 金褐霉素產品的核磁共振氫譜圖（1H-NMR）Fig.3 1H-NMR spectrum of aureofuscin product

3 結語

X-5大孔吸附樹脂金褐霉素吸附率和解吸率高，可以作為純化金褐霉素的樹脂。此方法建立了大孔吸附樹脂純化金褐霉素的方法，所得金褐霉素純度較高，是一種簡單實用的金褐霉素純化方法。采用大孔樹脂吸附分離方法制得的金褐霉素成品經高效液相分析含量和純度較高，比溶劑萃取法制得的含量提高很多，說明大孔吸附樹脂對金褐霉素的提取純化有一定的應用價值。經過分離提取工藝的深入研究，可以解決提取收率不高，難以達到產業化開發的問題。

通過紅外光譜、核磁共振碳譜和氫譜圖的分析，進一步鑒定我們得到的目的產物是金褐霉素，同時也更深入地了解金褐霉素的結構及其理化性質。

[1]上海藥物研究所金褐霉素研究小組．一種新的抗真菌的抗生素——金褐霉素[J]．微生物學報，1975，15（3）:180-187．Institute of Pharmaceutical Research in Shanghai （IPRS） in China.Aoriginal antimycotic antibiotic-aureofuscin[J].Chin J Microbiol，1975，15（3）:180-187.（in Chinese）

[2]Basilico J C，Debasilico M Z，Chlericattic，et al．Characterization and contron of thread mould in cheese[J]．Lett Appl Microbiol，2001，32（6）:419-423．

[3]王富金，武濟民．金褐霉素微生物檢定法[J]．抗生素，1980，5（5）:25-26．WANG Fu-jin，WU Ji-min.Aure ofuscin biological standardization[J].Antibiotic，1980，5（5）:25-26.（in Chinese）

[4]范德彰，蔡松年.金褐霉素治療真菌性角膜潰瘍——實驗研究及248例臨床療效觀察[J].中華眼科雜志，1985，21（5）:257-259.FAN De-zhang，CAI Song-nian.Aureofuscin cure mycotic corneal ulcer——empirical study and 248 clinical curative effect view[J].China Ophthalmology Journal，1985，21（5）:257-259.（in Chinese）

[5]Basilico J C，Debasilico M Z，Chlericatti C，et al.Characterization and contron of thread mould in cheese[J].Lett Appl Microbiol，2001，32（6）:419-423.

[6]魏杰，孟憲軍.金褐霉素高產菌株的選育及其發酵條件的優化[J].食品與生物技術學報，2009，28（2）:240-242.WEI Jie，MENG Xian-jun，JIANG Qiu-shi.Study on the breeding of high aureofuscin producing strains and their fermentation conditions[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（2）:240-242.（in Chinese）

[7]魏杰，孟憲軍.前體對金褐霉素生物合成的影響[J].食品與生物技術學報，2009，28（3）:429-432.WEI Jie，MENG Xian-jun.Effect of precursor on aureofuscin biosynthesis[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（3）:429-432.（in Chinese）

[8]高萍.大孔樹脂在天然藥物分離純化中的應用[J].天津藥學，2006，18（2）:63-66 GAO Ping.Application of macroporous adsorbing resins in the separation and purification of natural medicines[J].Tianjin Pharmacy，2006，18（2）:63-66.（in Chinese）

[9]黎海彬，李小梅.大孔吸附樹脂及其在天然產物研究中的應用[J].廣東化工，2005（3）:22-52.LI Hai-bin，LI Xiao-mei.Application of macroporous adsorbing resins in natural products research[J].Guangdong Chemical Industry，2005（3）:22-52.（in Chinese）

[10]黃少偉，池汝安，張越非，等.大孔吸附樹脂分離純化土茯苓總黃酮[J].中國中醫藥雜志，2008，33（10）:1133-1137.HUANG Shao-wei，CHI Ruan，ZHANG Yue-fei，et al.Separation and purification of flavonoids from Smilax glabra by macroporous adsorption resin[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2008，33（10）:1133-1137.（in Chinese）

[11]李晉，徐懷德，米林峰.洋蔥多糖的分離純化及單糖組成研究[J].中國食品學報，2012，12（2）:202-206 LI Jin，XU Huai-de，MI Lin-feng.Isolation，purification and monosaccharide analysis of polysaccharide from onion[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2012，12（2）:202-206.（in Chinese）

[12]Partanen R，Marie V，Macnaughtanw，et al.1H-NMR study of amylose films plasticised by glycerol and water[J].Carbohydrate Polymers，2004，56:147-155.

[13]Ruan R，Zou C，Wadhawan C，et al.Studies of water mobility and shelf life quality of precooked wild rice using pulsed NMR[J].Journal of Food Processing and Preservation，1996，21（2）:91-104.