五味子廢渣中多糖的分離及體外抗氧化活性

汪艷群， 孟憲軍， 劉 麗， 李 斌， 張 琦， 孫希云

（沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866）

氧化是一個重要的生化過程，正常的細胞功能需要一定濃度的自由基，但過量的自由基會損壞細胞中的脂質、蛋白質和DNA；自由基與許多疾病有關，如癌癥、風濕性關節炎、動脈粥樣硬化，并導致衰老[1-3]。雖然機體有對抗氧化損傷的防御和修復系統，但卻不能徹底阻止氧化損傷[4]。由于人工合成的抗氧化劑，如BHA、BHT、PG、TBHQ等會造成肝損傷并有致癌作用[5]，因此開發天然有效的抗氧化劑變得很有必要。五味子 （Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.），木蘭科多年生落葉藤本。五味子可食用也可藥用，常作為方劑用于治療和預防各種疾病，可用于生產藥品、保健品、化妝美容品和多種飲品、食品添加劑等。早期對五味子的研究大多集中在其脂溶性成分上，20世紀90年代以來，許多學者從五味子水提液中分離得到了多糖，發現其具有保肝、抗疲勞、增強免疫系統功能、降血糖、降血脂等多種生理功能[6-10]。作者利用提取過五味子脂溶性成分后的殘渣提取多糖，不僅可對副產物進行綜合利用，并在多糖分離純化中還可省去脫脂步驟；分離純化后對多糖抗油脂氧化能力及對羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O2-）、DPPH·自由基的清除能力進行了測試，以評價其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

五味子殘渣:實驗室提取五味子木脂素后殘渣；豬油:市售新鮮豬板油，文火熬制，過濾后備用；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （DPPH·）:分析純，Sigma公司；Sephacryl S-300 HR:瑞典 Pharmacia公司；聚酰胺（100～130目）、抗壞血酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鄰二氮菲，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等:均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

7200型可見分光光度計:尤尼柯（上海）有限公司；BSZ-100自動部分收集器:上海滬西分析儀器廠；紫外可見分光光度計:上海分析儀器廠；LC-10A型高效液相色譜儀:日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 干燥后的五味子殘渣，過40目篩，以料液比1∶40，90℃水浴浸提5 h，離心后收集上清液，采用酶法與三氯乙酸-正丁醇法結合除蛋白，蛋白酶用量為1%、酶解溫度為50℃、酶解時間為140 min、pH值5，酶解后離心得上清液，再用三氯乙酸-正丁醇法處理4次，每次處理均離心去除沉淀，最后將上清液透析，旋轉蒸發濃縮，用4倍體積的無水乙醇（乙醇終體積分數為80%）醇析5 h，收集沉淀即為五味子粗多糖。

1.2.2 五味子多糖的純化 五味子粗多糖用聚酰胺柱層析進行脫色和分離，再經Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析得到均一組分SCP-0。將SCP-0經紫外光譜、Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析法及凝膠滲透色譜法（GPC）進行純度鑒定。

1.2.3 抗氧化活性研究

1）對羥基自由基（·OH）清除能力的測定:以VC為參照物，試驗參考Liu等人[11]的方法，略作調整。取1.5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL，加0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 （pH 7.4）2.0 mL，充分混勻后，加1.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL，加入樣品溶液1.0 mL，每加一管立即混勻，加0.01%H2O2溶液1.0 mL。整個反應體系共6 mL體積。反應在37℃恒溫水浴中進行，準確反應1 h后，在536 nm波長處測定吸光度。損傷組（A1）中用1.0 mL去離子水代替樣品溶液；未損傷組（A0）中用2.0 mL去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。按下式計算樣品對·OH的清除率。

式中:AX為樣品組吸光度；A0為未損傷組吸光度；A1為損傷組吸光度。

2）對超氧陰離子自由基（·O2-）清除能力的測定:采用改良的鄰苯三酚自氧化法[12]，用10 mmol/L鹽酸溶解鄰苯三酚，制得30 mmol/L的溶液。取50 mmol/mL的Tris-鹽酸緩沖溶液 （pH 8.0）2.99 mL于試管中，加入0.01 mL上述鄰苯三酚溶液（同時按秒計時），立即攪拌混勻，倒入1 cm光徑比色杯中，在325 nm處測吸光度，1 min后開始計數據，每隔30 s記一次，一直記到4 min。按照下式計算鄰苯三酚自氧化速率（I0），要求 I0達到 0.07 min-1，若達不到此速率可通過調整鄰苯三酚的濃度來達到。空白管以10 mmol/mL鹽酸0.01 mL代替鄰苯三酚。

式中:A1為第1分鐘吸光度；A4為第4 min吸光度。

樣品活性測定:樣品管代替自氧化管，取50 mmol/mL 的 Tris-鹽酸緩沖溶液（pH 8.0）2.98 mL，加入0.01 mL的樣品溶液，再加入0.01 mL、30 mmol/mL的鄰苯三酚，其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。為消除色素影響，在空白管中加入和樣品管等量樣品液，鄰苯三酚用10 mmol/mL鹽酸0.01 mL代替。計算加樣后鄰苯三酚自氧化速率（IX），算出對·O2-的清除率。試驗以VC為參照物。

3）對DPPH自由基（DPPH·）清除能力的測定:參照Lu等人[13]的方法，試驗設樣品組和2個對照組。在2 mL的DPPH·醇溶液中加入2 mL樣品溶液，混勻后避光反應30 min，立即在517 nm波長處測定吸光度AX。對照組A1中用2 mL去離子水代替樣品溶液，對照組A2中用2 mL無水乙醇代替2 mL DPPH·醇溶液。按下式計算樣品對DPPH·自由基的清除率。試驗以VC為參照物。

式中:A1為無樣品組吸光度；A2為無DPPH·組吸光度；AX為樣品組吸光度。

4）抗豬油氧化能力的測定:參考李穎暢[14]的方法，準確稱取一定質量分數（0.25%、0.5%、1%）多糖及0.25%叔丁基對苯二酚（TBHQ），分別加入到50 g豬油中，劇烈攪拌均勻。同時以不加添加物的油脂作空白。將所有樣品放置于烘箱中，用烘箱高溫誘導豬油發生過氧化反應，在60～70℃下加速氧化。每隔2小時攪拌1次，并交換其在烘箱中的位置。每2天取出，按照GB5538-2005碘量法測定過氧化值（POV），以POV大小表示油脂的氧化進度，進而衡量抗氧化劑的活性。

2 結果與分析

2.1 純化及純度鑒定

2.1.1 聚酰胺柱層析 五味子多糖經過聚酰胺柱層析后得到3個組分，依次為SCP-A、SCP-B和SCP-C，見圖 1。分別稱質量，并與上樣量（1 g）比較，得到各組分所占比例見表1。

圖1 五味子多糖的聚酰胺柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of SCP on polyamide column

表1 五味子多糖的聚酰胺柱層析結果Table 1 Elution results of Schisandra chinensis polysaccharide on PV

由于SCP-A的質量分數較大，占總量的67.3%，為五味子多糖的主要組成，SCP-B和SCP-C的含量很少，不方便大量收集，所以本試驗只收集SCP-A，對其進行后續純化處理，SCP-B和SCP-C暫不研究。

2.1.2 Sephacryl S-300 HR柱層析 SCP-A經Sephacryl S-300柱層析后分離得到1個洗脫峰，見圖2。收集該峰組分，濃縮，自來水流動透析3 d，蒸餾水透析3 d（每3～4小時換一次蒸餾水），冷凍干燥，得白色蓬松粉末，命名為SCP-0，進行純度鑒定。

圖2 SCP-A的Sephacryl S-300 HR柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of SCP-A on Sephacryl S-300 HR column

2.1.3 五味子多糖SCP-0的純度鑒定

1）全波段光譜掃描:由全波段掃描光譜圖3可見，SCP-0在260、280 nm處無吸收，表明它不含蛋白質、多肽及核酸。

圖3 SCP-0的全波段掃描光譜Fig.3 Full wavelength scanning spectrum of SCP-0

2）Sephacryl S-300 HR凝膠過濾法:由圖4可見，SCP-0的Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析的洗脫曲線為單一洗脫峰，且峰形較為對稱，結合紫外吸收光譜的結果，判斷其可能為均一組分。

圖4 SCP-0的Sephacryl S-300 HR凝膠層析洗脫曲線Fig.4 Elution pattern of SCP-0 on Sephacryl S-300 HR

3）凝膠滲透色譜法（GPC）:SCP-0的凝膠色譜檢驗結果見圖5。有兩個組分峰，第一個峰為其主要組分，占SCP-0樣品的94.1%，該組分峰形陡峭尖銳，對稱性好，說明其分子均一性好，純度高。對于多糖這樣的高分子聚合物而言，通常所說的多糖純品實質上是一定相對分子質量范圍內的均一組分；純度只代表某一相似鏈長的平均配布，即均一組分所占比例。SCP-0中另一雜峰面積很小，說明SCP-0為純度較高的多糖，該純度已可滿足活性分析測定的要求，可用于抗氧化活性的測定分析。

圖5 五味子多糖SCP-0的GPC色譜圖Fig.5 Gel permeation chromatogram of sample SCP-0

2.2 抗氧化活性測定

2.2.1 對羥基自由基（·OH）清除能力的測定 羥自由基可以輕易穿過細胞膜，與碳水化合物、蛋白質、脂質和DNA等細胞內的生物大分子起化學反應，造成組織損傷或細胞死亡[15]。因此，清除羥自由基對生物系統很重要。從圖6可以看出，在試驗濃度范圍內，五味子多糖SCP-0表現出明顯的羥自由基清除能力，并且隨著質量濃度的增加，自由基清除率提高，表現出明顯的劑量依賴性；SCP-0比對照樣品VC的羥自由基清除能力強（p<0.05），其IC50為14.5 mg/mL。以上結果說明:五味子多糖SCP-0具有較好的羥自由基清除能力。

圖6 五味子多糖SCP-0對羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of SCP-0

2.2.2 對超氧陰離子自由基（·O2-）清除能力的測定試驗中，超氧陰離子由鄰苯三酚自氧化產生，VC為對照品。樣品對超氧陰離子的清除作用見圖7。從圖7可看出，五味子多糖SCP-0對超氧陰離子幾乎沒有清除作用。這個結果與對藍莓多糖[12]和地木耳多糖[16]抗氧化活性研究的結果相似。

圖7 五味子多糖SCP-0對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.7 Superoxide radical scavenging activity of SCP-0

2.2.3 對DPPH自由基（DPPH·）清除能力的測定抗氧化劑通過轉移傳遞電子或氫原子給DPPH來中和其自由基，因此，對DPPH自由基的清除效果可以反映抗氧化劑的供氫能力。從圖8可以看出，SCP-0對DPPH自由基的清除效果與其質量濃度緊密相關。SCP-0表現出了很強的DPPH自由基清除能力，其IC50為2.1 mg/mL，但仍不如對照樣品VC強。抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用被認為與其供氫能力有關，因此，以上結果提示五味子多糖SCP-0可能具有較強的供氫能力。

圖8 五味子多糖SCP-0對DPPH自由基的清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging activity of SCP-0

2.2.4 抗豬油氧化能力的測定 從圖9可以看出，多糖組的POV在前6天增長較為緩慢，在這個階段產生的自由基會被五味子多糖有效地清除掉，各樣品組的POV都明顯低于空白組，并且隨多糖添加量的增大，對POV上升的抑制越明顯（p＜0.05）。之后進入一個快速增長的階段，各多糖組均表現出對氧化速度的難以抑制。從第14天開始，隨著一些自由基碰撞結合生成雙聚物，體系中的自由基數量有所減少，多糖組的自由基清除效果開始顯現，使氧化的進程放緩，而空白組的POV曲線保持著傳播期（6～14 d）陡峭上升的勢頭。TBHQ，作為一個已知的強效抗氧化劑，在整個試驗時期都表現出非常強的抑制油脂氧化的能力。從以上結果可知，五味子多糖具有一定的抗油脂氧化能力，且抗氧化能力隨用量的增加而提高，但與人工合成的抗氧化劑TBHQ相比仍有差距。

圖9 五味子多糖SCP-0抗豬油氧化能力Fig.9 Antioxidative activity of SCP-0 on lard oxidation

3 結語

作者從五味子殘渣中通過水提醇沉法提取得到五味子粗多糖，通過聚酰胺柱層析及Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析對五味子多糖進行純化，得到純度為94.6%的均一組分SCP-0，對其體外抗氧化活性研究表明:SCP-0對·OH具有較好的清除效果，IC50為14.5 mg/mL；對DPPH·具有較好的清除效果，IC50為2.1 mg/mL；但對·O2-無明顯清除效果；具有一定的抗油脂氧化能力，在低自由基濃度水平下效果更明顯。SCP-0具有開發為天然抗氧化劑的潛力。

[1]Zhang Z F，Jin J，Shi L G.Antioxidant activity of the derivatives of polysaccharide extracted from a Chinese medical herb（Ramulus mori）[J].Food Science and Technology Research，2008，14:160-168.

[2]Salvemini D，Wang Z Q，Zweier J L，et al.A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase with therapeutic activity in rats[J].Science，1999，286:304-306.

[3]Melov S，Ravenscroft J，Malik S，et al.Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics[J].Science，2000，289:1567-1569.

[4]Zhao L，Zhao G H，Du M，et al.Effect of selemium on increasing free radial scavenging activities of polysaccharide extracts from a Se-enriched mushroom species of the genus Ganoderma[J].Europe Food Research Technology，2008，226:499-505.

[5]Grice H C.Safety evaluation of butylated hydroxyanisole from the perspective of effects on forestomach and oesophageal squamous epithelium[J].Food Chemistry and Toxicology，1988，26:717-723.

[6]李曉光.五味子多糖的研究概況[J].時珍國醫國藥，2006（6）:67-69.LI Xiao-guang.Review of research on Schisandra chinensis polysaccharide[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2006（6）:67-69.（in Chinese）

[7]陳文靜，季宇彬.五味子多糖藥理作用的研究進展[J].食品與藥品，2007，9（12）:66-67.CHEN Wen-jing，JI Yu-bin.Progress on pharmacological action of Fructus schisandrae polysaccharide[J].Food and Drug，2006（6）:67-69.（in Chinese）

[8]苗明三，方曉艷.五味子多糖對正常小鼠免疫功能的影響[J].中國中醫藥科技，2003，10（2）:100.MIAO Ming-san，FANG Xiao-yan.Effect of Schisandra chinensis （Turcz） baill polysaccharide on Mice’s immunological functions[J].Chinese Journal of Traditional Medical Science and Technology，2003，10（2）:100.（in Chinese）

[9]高曉旭，孟憲軍，李繼海.北五味子活性多糖降脂減肥作用的研究[J].食品工業科技，2008，29（11）:248-250.GAO Xiao-xu，MENG Xian-jun，LI Ji-hai.Studay on hypoglycemic activity and ultrasonic wave extraction of polysaccharides from fruit of Schisandra chinensis （Turcz） baill[J].Science and Technology of Food Industry，2008，29 （11）:248-250.（in Chinese）

[10]Gao X X，Meng X J，Li J H，et al.Hypoglycemic effects of a water-soluble polysaccharide isolated from Schisandra chinensis（Turcz.） bail in alloxan-induced diabetic mice[J].Journal of Biotechnology，2008（1365）:5725.

[11]Liu X P，Luan J J，Christopher E P.Comparison of the antioxidant activity amongst Gingko biloba extract and its main components[J].Journal of Chinese Medicinal Materials，2009，32:736-740.

[12]孟憲軍，孫希云，朱金艷，等.藍莓多糖的優化提取及抗氧化性研究[J].食品與生物技術學報，2010（1）:56-60.MENG Xian-jun，SUN Xi-yun，ZHU Jin-yan，et al.Extraction and antioxidant capability of blueberry polysaccharides[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010（1）:56-60.（in Chinese）

[13]Lu Y R，Yeap Foo L.Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace[J].Food Chemistry，2000，68:81-85.

[14]李穎暢，馬春穎，孟憲軍，等.藍莓花色苷提取物抗油脂氧化能力的研究[J].中國糧油學報，2010，25（2）:92-95.LI Ying-chang，MA Chun-ying，MENG Xian-jun，et al.Antioxidation of anthocyanins from blueberry fruits[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2010，25（2）:92-95.（in Chinese）

[15]Yuan J F，Zhang Z Q，Fan Z C，et al.Antioxidant effects and cytotoxicity of three purified polysaccharides from Ligusticum chuanxiong Hort[J].Carbohydrate Polymers，2008，74:822-827.

[16]張唐偉，楊樂，柳青海，等.地木耳多糖的抗氧化性與抑菌作用[J].食品與生物技術學報，2011，30（6）:868-873.ZHANG Tang-wei，YANG Le，LIU Qing-hai，et al.Antioxidant and antimicrobial activities of Nostoc commune polysaccharides[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（6）:868-873.（in Chinese）