蛹蟲草Cordyceps militaris JN168產(chǎn)蟲草素液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

岳翠翠 ， 沈健增 ， 蔡宇杰 *， 廖祥儒 ， 羅軍俠 ， 張大兵

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安 223001）

蛹蟲草學(xué)名為Cordyceps militaris，俗稱北冬蟲夏草、北蛹蟲草、蟲草等，屬子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科、蟲草屬[1]。蛹蟲草是中國傳統(tǒng)藥用真菌中的一種。現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究證明，蛹蟲草中含有蟲草素、蟲草酸和蟲草多糖等多種有效成分，可用于肺結(jié)核、老人虛弱和貧血等疾病的治療[2]。蟲草素是蛹蟲草有效成分中的重要活性物質(zhì)。蟲草素（cordycepin）又稱蟲草菌素、蛹蟲草菌素，是由Cunningham等在1951年首先從蛹蟲草Cordyceps militaris的培養(yǎng)濾液中分離得到，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素[3]。其分子式為C10H13N5O3，結(jié)構(gòu)式見圖1。相對分子質(zhì)量為251，堿性，針狀或片狀結(jié)晶[4]。蟲草素是一種天然來源的藥物，對DNA和RNA合成，hnRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾以及腺苷酸環(huán)化酶等均具有抑制作用，具有抗炎、抗真菌、抗癌及抗病毒等多種生理活性[5]。蟲草素在美國已進入臨床實驗研究，用于白血病的治療[2]。目前蟲草素的研究現(xiàn)正成為藥物化學(xué)中一個極其活躍的領(lǐng)域。蟲草素在自然界中被發(fā)現(xiàn)僅存在于蟲草屬（cordyceps）真菌中，其中在蛹蟲草中含量較高，是目前生產(chǎn)蟲草素的主要菌種[6-7]。蛹蟲草能產(chǎn)生蟲草素，其菌絲體生長過程中98%的蟲草素分泌到培養(yǎng)基中[8]。所以利用蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素是一種較好的方法。作者對蛹蟲草產(chǎn)蟲草素的液態(tài)發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，以期提高蟲草素的產(chǎn)量，為蟲草素的工廠化生產(chǎn)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 蟲草素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of cordycepin

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 蛹蟲草Cordyceps militaris JN168，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2011333。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面 PDA 培養(yǎng)基（組分 g/L）:馬鈴薯 200，葡萄糖20，瓊脂20；pH值自然，121℃滅菌20 min。

2）種子培養(yǎng)基（組分 g/L）:葡萄糖 40，酵母膏10，MgSO40.5；pH 值自然，121 ℃滅菌 20 min。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（組分 g/L）:蔗糖 30，蛋白胨 10；pH值自然，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 種子制備 將菌株Cordyceps militaris JN168接種于PDA斜面培養(yǎng)基，25℃光照培養(yǎng)7 d，用無菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，用4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成孢子數(shù)為106倍的孢子懸液。取制好的孢子懸液，以5%接種體積分?jǐn)?shù)接種于PDA種子培養(yǎng)基中，25℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)3 d，即可獲得種子培養(yǎng)液。

1.2.2 液態(tài)發(fā)酵 取種子培養(yǎng)液，以5%接種體積分?jǐn)?shù)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量50 mL，培養(yǎng)溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，搖瓶培養(yǎng)8 d。

1.2.3 生物量的測定 將得到的發(fā)酵原液以8 000 r/min離心20 min，收集濕菌體，用蒸餾水洗滌3次后，置于60℃下恒溫干燥至恒質(zhì)量，用電子天平稱質(zhì)量。

1.2.4 發(fā)酵液中蟲草素質(zhì)量濃度的測定 將得到的發(fā)酵原液以8 000 r/min離心20 min，取上清液，然后用HPLC法測定上清液中蟲草素的質(zhì)量濃度，測定波長為260 nm，流動相為20%的甲醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別以等質(zhì)量的葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、D-半乳糖、甘露糖、山梨糖、可溶性淀粉或馬鈴薯淀粉來代替基本培養(yǎng)基中的碳源蔗糖，進行不同碳源對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響實驗。由表1可知，產(chǎn)蟲草素發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為葡萄糖；蛹蟲草可以很好的利用單糖、二糖，而可溶性淀粉和馬鈴薯淀粉則不利于菌體的生長。

表1 碳源對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響Table 1 Effect of carbon sources on cell growth and the production of cordycepin

2.2 葡萄糖添加量對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響

用選出的碳源葡萄糖，設(shè)置其質(zhì)量濃度為20、25、30、35、40、45、50、55 g/L， 進行不同質(zhì)量濃度的葡萄糖對Cordyceps militaris JN168產(chǎn)菌體生長和蟲草素的影響實驗。由圖2可知，葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L時蟲草素的質(zhì)量濃度最高，菌體質(zhì)量濃度達到最高時，葡萄糖的質(zhì)量濃度為30 g/L。

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度對蛹蟲草菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on cell growth and the production of cordycepin

2.3 氮源對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響

用選出的碳源葡萄糖40 g/L，分別用等氮量的酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、麥芽汁、酒石酸銨、乙酸銨 、（NH4）2SO4或 NH4NO3為 氮 源 ， 進 行 氮 源 對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響實驗。由表2可知，有機氮源的效果明顯比無機氮源好；以牛肉膏為氮源時，蟲草素的產(chǎn)量最高；以蛋白胨、酵母浸粉為氮源時，蟲草素的產(chǎn)量次之；以麥芽汁和銨鹽為氮源時，蟲草素的產(chǎn)量最低；與無機氮源相比，有機氮源更可以滿足菌體生長的需要，其中蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉的效果較好。由上述可知，Cordyceps militaris JN168產(chǎn)蟲草素發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源為牛肉膏。

表2 氮源對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響Table 2 Effect of nitrogen sources on cell growth and the production of cordycepin

2.4 牛肉膏添加量對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響

用選出的最佳氮源牛肉膏，設(shè)置其質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L， 進行不同濃度的牛肉膏對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響實驗。由圖3可以看出，Cordyceps militaris JN168產(chǎn)蟲草素的牛肉膏最佳質(zhì)量濃度為15 g/L，菌體生長的最佳質(zhì)量濃度為10 g/L。

圖3 牛肉膏質(zhì)量濃度對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響Fig.3 Effect of beef extract concentration on cell growth and the production of cordycepin

2.5 無機鹽對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響

以上述優(yōu)化出的碳源和氮源為基本培養(yǎng)基，在基 本 培 養(yǎng) 基 中 加 入 KCl、MgSO4、K2HPO4、Na2HPO4、CaCl2或NaCl，進行不同無機鹽對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響實驗。由表3可以看出，在培養(yǎng)基中加入 MgSO4、K2HPO4、CaCl2、Na2HPO4可以促進蟲草素的產(chǎn)生，而加入KCl、NaCl 則 抑 制 蟲 草 素 的 產(chǎn) 生 ；MgSO4、K2HPO4、CaCl2、Na2HPO4對菌體得生長影響較小，KCl、NaCl抑制菌體的生長。

表3 無機鹽對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的影響Table 3 Effect of inorganic salts on the production of cordycepin and cell growth

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

依據(jù)無機鹽單因素實驗結(jié)果，應(yīng)用Central Composite Design（CCD）實驗原理，對培養(yǎng)基中MgSO4、K2HPO4、CaCl2和 Na2HPO4進行了四因素三水平響應(yīng)面分析實驗[9]，試驗設(shè)計與結(jié)果見表4和表5。

表4 響應(yīng)面分析試驗因素水平表Table 4 Factor and levels for response surface analysis

表5 響應(yīng)面中心組合設(shè)計及試驗結(jié)果Table 5 Response surface central composite design and corresponding experiment results

由此實驗的實際值用二次多項式進行回歸，其結(jié)果見表6。

表6 試驗結(jié)果的回歸分析Table 6 Regression analysis of the experiment results

由表6中的回歸系數(shù)可以寫出二次多項式回歸方程為:

對該分析方程進行方差分析，方差分析結(jié)果見表7。從方差分析中可以看出，模型P＜0.05表明該模型是顯著的。 同時模型中的參數(shù) X2，X3，X4，X12，X22，X32，X42是顯著的（P 值小于 0.05）。 模型失擬項表示預(yù)測值與實際值不擬合的概率[10-11]。該模型失擬項的P值為0.0528，表示有5.28%的概率使得模型偏差由噪音產(chǎn)生，因此模型失擬項不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.915 0，說明了91.50%的響應(yīng)值是由該模型決定的。R值為0.956 6說明實驗中蟲草素質(zhì)量濃度的實際值與模型預(yù)測值有95.66%的一致性。由此表明，該模型可對實驗結(jié)果進行較準(zhǔn)確的預(yù)測。

利用Design Expert 7.0軟件對試驗結(jié)果進行分析[12]，得到培養(yǎng)基中加入的 MgSO4、K2HPO4、CaCl2和Na2HPO4的最適質(zhì)量濃度分別為 0.76、0.63、0.66、0.67 g/L。在此條件下預(yù)測得到的蟲草素質(zhì)量濃度為669.56 mg/L。

表7 二次多項式回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for quadratic polynomial model

2.7 優(yōu)化前后Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的情況

優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基；優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖40 g/L，牛肉膏15 g/L，MgSO40.76 g/L，K2HPO40.63 g/L，CaCl20.66 g/L，Na2HPO40.67 g/L。優(yōu)化前后 Cordyceps militaris JN168菌體生長和產(chǎn)蟲草素的情況見圖4、5。和優(yōu)化前相比，優(yōu)化后Cordyceps militaris JN168菌體生長及產(chǎn)蟲草素有相同的趨勢，菌體干重在第4天達到最大，發(fā)酵液中蟲草素的質(zhì)量濃度在第8天達到最高，故選擇8 d為發(fā)酵時間最合適。優(yōu)化前發(fā)酵液中蟲草素質(zhì)量濃度為106.03 mg/L，優(yōu)化后發(fā)酵液中蟲草素濃度達到633.47mg/L，是優(yōu)化前的6倍。

圖4 優(yōu)化前后Cordyceps militaris JN168菌體生長的情況Fig.4 Curves of cell growth before and after optimization

圖5 優(yōu)化前后Cordyceps militaris JN168產(chǎn)蟲草素的情況Fig.5 Curves of the production cordycepin before and after optimization

3 結(jié)語

隨著對蟲草素藥用活性研究的深入，人們對蟲草素的需求逐漸增大，制備大量的蟲草素就成了制約蟲草素研究和開發(fā)的瓶頸。目前蟲草素的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成和生物合成兩種方法。化學(xué)合成存在很大的缺陷，得率低，合成過程中使用大量有機溶劑（如氯仿等）對環(huán)境會造成污染，因此目前應(yīng)用最多的還是利用蟲草屬真菌進行生物合成來獲得蟲草素[13]。其中利用蛹蟲草發(fā)酵生物合成蟲草素具有其它菌種不可比擬的優(yōu)勢，其蟲草素合成量要遠遠高于冬蟲夏草等菌株。蛹蟲草發(fā)酵合成蟲草素有寄主培養(yǎng)、固態(tài)培養(yǎng)、代料栽培和液體培養(yǎng)等方式，與其他方式相比蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵獲得蟲草素具有培養(yǎng)條件易控制、培養(yǎng)基成分來源廣、發(fā)酵產(chǎn)物易提取等優(yōu)點[14]，而產(chǎn)量低，發(fā)酵時間長是其不可忽略的缺點。國內(nèi)外主要從培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)條件和菌種等方面加以優(yōu)化，從而提高蟲草素含量，縮短發(fā)酵時間。

通過研究，確定了蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的優(yōu)化條件為:

1）Cordyceps militaris JN168發(fā)酵產(chǎn)蟲草素最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖40 g/L，牛肉膏15 g/L，MgSO40.76 g/L，K2HPO40.63 g/L，CaCl20.66 g/L，Na2HPO40.67 g/L，發(fā)酵時間8 d，此時該菌發(fā)酵液蟲草素質(zhì)量濃度達到633.47 mg/L。

2）Cordyceps militaris JN168發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的發(fā)酵時間為8 d，與劉艷芳等 （2010），和鐘思敏等（2011）報道的28、9 d相比，顯著縮短了發(fā)酵時間。

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