耐熱木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達及酶學性質

張慧敏， 李劍芳， 鄔敏辰， 魏喜換， 楊嚴俊

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 醫藥學院，江蘇 無錫 214122）

β-1，4-內切木聚糖酶 （endo-β-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8），能從木聚糖主鏈的內部隨機切割木糖苷鍵，將其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖。根據催化結構域氨基酸的同源性和疏水簇分析法可將木聚糖酶劃分為糖苷水解酶10家族和11家族[1]。木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織等工業領域都有著重要的應用價值，但由于紙漿漂白、飼料制粒等工藝均需要較高溫度，因此耐熱木聚糖酶的研究和開發得到了很多研究者的青睞[2]。目前已發現了許多能產11家族耐熱木聚糖酶的微生物，如Thermomyces lanuginosus[3]，Paecilomyces varioti[4]，Dictyoglomus thermophilum[5]，Chaetomium thermophilum和Nonomuraea flexuosa[6]等，其中許多耐熱木聚糖酶基因已被克隆并表達在合適的宿主中[3，7]。畢赤酵母表達系統由于能高效分泌外源蛋白質到胞外，并能進行高密度發酵，因而在木聚糖酶研究中備受關注[8]。

EvXyn11TS是一種來源于細菌的極端耐熱木聚糖酶突變體（GenBank登錄號 EU591743），它的熱穩定性非常好，在90℃下處理 60 min酶活不下降[9]，具有適合于工業應用的理想特性。為實現EvXyn11TS在工業上的應用。擬將該耐熱基因在畢赤酵母 （Pichia pastoris）GS115中的進行分泌表達，但是由于它來源于細菌，其密碼子偏好性與畢赤酵母有較大差異，于是對此耐熱基因中的稀有密碼子進行優化，并命名為Syxyn11。采用人工方法合成Syxyn11基因，后通過分子生物學手段獲得重組畢赤酵母基因工程菌，對重組木聚糖酶進行酶學性質研究，為耐熱木聚糖酶的工業化生產和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和培養基

E.coli DH5α、P.pastoris GS115 和 表 達 質 粒pPIC9K:由作者所在實驗室保藏；pUCm-T質粒:購自上海 Sangon公司；LB、YPD、MD、BMGY 和 BMMY培養基:參見Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊。

1.2 主要試劑

rTaq酶、T4 DNA連接酶、各種限制性內切酶、250 bp DNA Ladder Marker和低相對分子質量蛋白質 Marker:購于大連 TaKaRa公司；Tryptone、Yeast Extract、YNB、G418 和 EZ-10 Spin Column Plasmid Mini-Preps Kit:購自上海Sangon公司；標準木糖、櫸木木聚糖:購于Sigma公司；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.3 重組質粒pUCm-T-Syxyn11的構建

根據密碼子的偏愛性，宿主細胞能夠以不同的速度合成蛋白質。編碼蛋白質的基因中有些密碼子對應的tRNA含量少（即屬于稀有密碼子），所以合成量較少，宿主以此來控制蛋白質的合成速度。因此按照密碼子的偏好性，對外源蛋白質編碼基因進行密碼子優化可以有效提高外源蛋白質的表達量[10]。為實現來源于細菌的耐熱木聚糖酶基因Evxyn11TS在P.pastoris中的高表達，對Evxyn11TS成熟肽基因序列（585 bp）進行分析，發現其密碼子的偏好性與畢赤酵母有很大差異。遂對照畢赤酵母密碼子偏好性表對Evxyn11TS中的稀有密碼子進行優化，并在基因兩端分別加入EcoRⅠ、NotⅠ位點，該基因命名為Syxyn11，合成后克隆至pUCm-T質粒，獲得重組質粒pUCm-T-Syxyn11，并對其進行測序，測序結果與預期相符。

1.4 重組表達質粒的構建

將重組質粒pUCm-T-Syxyn11進行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，割膠回收約600 bp的目的基因Syxyn11，與經同樣雙酶切的質粒pPIC9K連接，轉化E.coli DH5α感受態細胞，經通用引物（5’-AOX和3’-AOX）PCR篩選鑒定后，測序正確的重組質粒命名為pPIC9K-Syxyn11。

1.5 Syxyn11在P.pastoris中的表達

pPIC9K-Syxyn11經SalⅠ線性化后，用電穿孔法將其導入P.pastoris GS115中，涂布于MD平板上篩選重組畢赤酵母；將在MD平板上生長良好的菌落用牙簽點種至含不同質量濃度G418的YPD平板上篩選抗高質量濃度G418（2.0 mg/mL）的重組畢赤酵母，命名為GS115/Syxyn11；同時電轉pPIC9K至P.pastoris GS115做對照，并命名為GS115/9K。參照《分子克隆實驗指南》中的方法[11]提取重組子的基因組DNA。以此為模板，利用通用引物5′-AOX和3′-AOX進行PCR驗證。耐熱木聚糖酶基因Syxyn11的常規誘導表達參見Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen 公司）操作手冊。

1.6 木聚糖酶的活性測定及分析

木聚糖酶酶活測定采用改良的DNS試劑法[12]，用櫸木木聚糖作為底物，其中酶反應溫度設定為65℃，以在測定的條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。蛋白質質量分數測定采用考馬斯亮藍染色法 （Bradford法），以牛血清白蛋白為標準。并采用SDS-PAGE對表達產物進行分析及表觀相對分子質量的測定。

1.7 重組木聚糖酶酶學性質分析

1.7.1 酶的最適反應溫度及熱穩定性 取適當稀釋酶液于55～95℃水浴條件下進行酶解反應，每隔5℃測定酶活，以酶活力最高者為100%，作溫度—相對酶活性曲線；將酶液于不同溫度下保溫不同時間后，按常規方法測定殘余酶活性，以0 min時取出的酶液的酶活性為100%，作溫度——相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩定。

1.7.2 酶的最適pH及pH穩定性 65℃下，分別測定木聚糖酶在不同pH值下的酶活性。以酶活力最高者為100%，作pH—相對酶活性曲線；將酶在不同的pH值條件下于40℃保溫1 h，再分別測定殘留酶活性，以酶活力最高者為100%，作pH—相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩定。反應所用的緩沖液為:0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 （pH 3.5～8.0）和0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化納緩沖液（pH 8.5～9.5）。

1.7.3 金屬離子對酶活性的影響 將不同金屬離子溶液與酶液混合，至終濃度為2 mmol/L，40℃保溫1 h，然后按常規方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為100%，殘余酶活與其的比值為相對酶活。

2 結果與討論

2.1 表達質粒pPIC9K-Syxyn11的構建

通過密碼子優化后獲得重組質粒pUCm-TSyxyn11，將其用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，1.0 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分離。如圖1所示，在約2.7 kb和0.6 kb處可見特異性DNA條帶，分別為線性化的pUCm-T和目的基因Syxyn11。將Syxyn11與經同樣雙酶切的質粒pPIC9K連接，轉化DH5α。經通用引物鑒定后，篩選得到重組質粒pPIC9K-Syxyn11，測序結果與預期相符，并將該優化序列提交至GenBank核酸數據庫，登陸號為JX459567。

圖1 pUCm-T-Syxyn11的EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切電泳圖Fig.1 Double digestion of pUCm-T-Syxyn11 by EcoRⅠand NotⅠ

2.2 畢赤酵母重組子的鑒定

以高拷貝重組畢氏酵母GS115/Syxyn11基因組為模板，進行PCR擴增鑒定，PCR產物經1.0 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析，見圖2。GS115/Syxyn11的PCR產物在1.1 kb和2.1 kb處可見兩條清晰的條帶（圖2泳道2～3），而對照組GS115/9K PCR產物的兩條條帶大小分別為0.49 kb和2.1 kb（圖2泳道1），表明Syxyn11已整合入GS115/Syxyn11基因組內。

圖2 畢赤酵母重組子基因組PCR驗證Fig.2 Verification of P.pastoris transformants by PCR

2.3 重組蛋白的表達和鑒定

挑選GS115/Syxyn11菌落和GS115/9K菌落進行常規誘導表達96 h，8 000 r/min離心10 min后收集上清液，取上清液用改良的DNS法測定木聚糖酶活性。結果表明，GS115/Syxyn11發酵液上清液木聚糖酶酶活可達到17.74 U/mL，而GS115/9K并未檢測到木聚糖酶活性。SDS-PAGE結果見圖3。GS115/Syxyn11的表達產物在相對分子質量31 000處有明顯的目的蛋白SyXyn11條帶（圖3泳道2），而對照GS115/9K在該處無條帶（圖3泳道1）。SyXyn11相對分子質量比前期測出的相對分子質量 （21 000）大，分析其原因可能是由于SyXyn11氨基酸序列中含有3個N-糖基化位點及在C末端的兩個O-糖基化位點。

圖3 表達產物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed products

2.4 重組木聚糖酶酶學性質

2.4.1 酶的最適反應溫度及熱穩定性 由圖4可以看出，在80～90℃范圍內，SyXyn11酶活力較高，相對酶活可達85%以上，其中最適反應溫度為85℃；從熱穩定性曲線可看出，SyXyn11在80℃以下較穩定，如在80℃保存60 min后，酶活僅損失14.1%。說明該酶的熱穩定性好，在高溫下可長時間保持穩定。

圖4 溫度對SyXyn11酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of the SyXyn11

2.4.2 酶的最適pH及pH穩定性 在不同pH值下進行酶活性檢測，結果見圖5。該酶的最適反應pH為6.5，當pH＜5.5或者pH＞7.5時，酶活力下降較快；該重組酶在pH 5.0～7.5范圍內穩定，當pH值低于5.0或高于7.5時，該酶的穩定性較差，如酶液分別在pH 4.5和pH 8.0下保存1 h，酶活分別損失40%、30%。

圖5 pH對SyXyn11酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of the SyXyn11

2.4.3 金屬離子對酶活性的影響 如圖6所示，EDTA和大多數供試金屬離子對重組酶的活性影響不大，這說明該酶對大部分金屬離子都具有抗性，能夠應用于不同的工業加工過程，具有重要的應用價值。

圖6 金屬離子和EDTA對SyXyn11酶活力的影響Fig.6 Effects of various metal ions and EDTA on the activity of the SyXyn11

3 結語

由于耐熱木聚糖酶具有重要的工業應用價值，通過基因工程實現耐熱木聚糖酶的異源高效表達是降低其工業應用成本、適應工業應用條件的有效手段。目前，已經有許多耐熱木聚糖酶基因在畢赤酵母中實現了分泌表達。Ghaffar等克隆了來自于C.thermophilum的耐熱木聚糖酶基因xyn11A，并在P.pastoris GS115中進行了表達，其最高酶活可達到15.6 U/mL[7]。

作者成功實現了11家族耐熱木聚糖酶基因Syxyn11在P.pastoris GS115中的分泌表達，通過甲醇誘導發酵，酶活可高達17.74 U/mL。通過SDS-PAGE鑒定出重組木聚糖酶SyXyn11的相對分子質量在31 000左右。酶學性質研究表明，該重組酶的最適反應溫度為85℃，80℃以下穩定；最適反應pH 6.5，并在pH 5.0～7.5時穩定；EDTA和大多數供試金屬離子對重組酶的活性影響不大。據文獻報道的最耐熱木聚糖酶是N.flexuosa所產的Xyn11A，其最適溫度為80℃[6]，而SyXyn11比以往報道的任何11家族木聚糖酶具有更高的耐熱性，使得該酶在許多工業領域中可能具有一定的應用潛力和優勢。然而該酶在P.pastoris中的表達量并不高，因此如何提高它的表達量將是下一步研究的重點。

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