蘆筍醇提取物的免疫調(diào)節(jié)作用

王 芳 ， 馬淑鳳 *， 李漢臣 ， 王周平 ， 黃云祥 ， 代 卉

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.河北師范大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 秦皇島066600）

蘆筍 （Asparagus officinalis L.） 俗稱石刁柏、龍須菜等，被世界衛(wèi)生組織列為世界十大最具有營養(yǎng)價(jià)值的蔬菜之首，是國際上公認(rèn)的防癌保健蔬菜[1]。蘆筍不僅可以食用，其加工殘?jiān)锟梢宰鳛樘K云金芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基[2]。蘆筍含有多種活性成分，如黃酮、蘆筍多糖、氨基酸、微量元素、皂苷[3]等。隨著蘆筍的大量種植，我國已成為世界上第一大蘆筍生產(chǎn)國和出口國，蘆筍產(chǎn)業(yè)在我國得到迅猛發(fā)展。許多研究者不僅對蘆筍的加工生產(chǎn)[4]、組成成分與結(jié)構(gòu)化學(xué)成分[5]和貯藏過程中功能成分的變化[6]做了系統(tǒng)研究，而且對蘆筍的抗疲勞[7]、抗腫瘤[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、抗炎[10]等生物活性進(jìn)行了部分研究。蘆筍的保健功能成為近些年國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)之一。Gautam M等人[9]對蘆筍根水提取物調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群的免疫活性做了較深入研究。然而許多生物活性物質(zhì)是通過作用于免疫器官或者調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞來發(fā)揮免疫作用的。因此，本實(shí)驗(yàn)以風(fēng)干蘆筍的乙醇提取物為研究對象，對其特異性和非特異性免疫功能進(jìn)行了初步研究，旨在為蘆筍的保健食品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

蘆筍醇提取物由秦皇島長勝農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 試劑

菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉/永葉生物科技有限公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院提供；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，胎牛血清，生工生物工程上海有限公司提供；刀豆蛋白 A（ConA），噻唑藍(lán)（MTT），Sigma 公司提供；綿羊紅細(xì)胞 （SRBC），廣州蕊特生物科技有限公司提供；豚鼠血清:健康豚鼠心臟取血，離心，分離出血清；谷氨酰胺，華美生物工程公司提供；HEPES、FITC異硫氰酸熒光素，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 主要儀器

Zenth 3100型，熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀，奧地利Anthos產(chǎn)品；MK3酶標(biāo)儀，上海雷勃分析儀器廠產(chǎn)品；超低溫冰箱，SANYO公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Forma公司產(chǎn)品；凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；倒置式生物顯微鏡，重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品；UV2800型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

30 日齡健康昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，單一雄性:上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，動物合格證號2007000517939。

1.5 蘆筍乙醇提取物的成分分析

蘆筍乙醇提取物中總皂苷含量的測定采用香草醛-高氯酸法[11]:精確吸取各質(zhì)量濃度菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液 （分別為 0、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 mg/mL）0.5 mL，70℃水浴揮干溶劑，加入新配制的5 g/dL香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻密封，于70℃水浴15 min，取出，立即用冷水冷卻，加入5 mL的冰乙酸，搖勻，反應(yīng)5 min，以溶劑作空白，于535 nm處測吸光度，以吸光度（A）對菝葜皂苷元質(zhì)量濃度（C）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取0.40 mg干燥至恒重的蘆筍乙醇提取物溶解于10 mL甲醇中，按上述步驟操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物中的總皂苷含量。

總多糖含量采用蒽酮-硫酸法測定[12]:精密量取不同質(zhì)量濃度葡萄糖對照品水溶液 （分別為0、0.018、0.036、0.054、0.09 和 0.108 mg/mL）各 1.0 mL于10 mL的玻璃離心管中，分別加入0.2 g/dL蒽酮硫酸試劑4 mL，混勻，立即置冰水浴中冷卻5 min，取出后置沸水浴中加熱10 min，取出，置冷水流中冷卻至室溫。以溶劑為空白，于626 nm處測定吸收度，以吸光度（A）對葡萄糖質(zhì)量濃度（C）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取0.40 mg干燥至恒重的蘆筍乙醇提取物溶解于10 mL蒸餾水中，按上述步驟操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物中的總多糖含量。

總游離氨基酸采用茚三酮法測定[13]:分別精密量取不同質(zhì)量濃度天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品水溶液（分別為0、0.015、0.03、0.045 和 0.09 mg/mL）各 1.0 mL 于 10 mL的量瓶中，分別加入醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）2 mL和3 g/dL的茚三酮70%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液1 mL，混勻，沸水浴加熱15 min，取出，冷卻至室溫，加水定容至刻度，搖勻。以溶劑為空白，在570 nm波長處測定吸收度，以吸光度（A）對天冬氨酸質(zhì)量濃度（C）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取0.40 mg干燥至恒重的蘆筍乙醇提取物溶解于10 mL蒸餾水中，按上述步驟操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物中的總游離氨基酸含量。

1.6 動物實(shí)驗(yàn)

48只昆明種小鼠，按體重隨機(jī)均分成4組:空白對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。低、中、高劑量組分別按7、70、140 mg/kg蘆筍醇提物灌胃，對照組按10 mL/kg灌胃無菌生理鹽水。每日一次，連續(xù)灌胃30 d，第25天 所有小鼠均腹腔注射0.2 mL 2%體積分?jǐn)?shù)的壓積綿羊紅細(xì)胞進(jìn)行免疫。末次給藥后禁食12 h后處理。

1.6.1 小鼠免疫器官胸腺、脾臟質(zhì)量法測定 根據(jù)按《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）中的方法測定[14]。

1.6.2 蘆筍乙醇提取物對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 無菌取腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整巨噬細(xì)胞濃度為 2×106mL，RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，100 μL/孔，37℃，CO2下培養(yǎng)4 h，貼壁，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加蘆筍乙醇提取物100 μL培養(yǎng) 24 h，4 000 r/min離心10 min，去上清液，將標(biāo)記濃縮液調(diào)細(xì)胞數(shù)至1×108mL，100 μL/孔加入已處理的腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，將培養(yǎng)板放置冰上5 min，終止吞噬反應(yīng)，300 g，5 min，4 ℃離心，去上清液，加冷 PBS洗滌2次，加100 μL PBS，混勻，485 nm激發(fā)光，530 nm發(fā)射光測定熒光值，此值為吞噬及表面熒光總和。詳見文獻(xiàn)[15]。

將上述測定板離心，去上清液，加1 g/dL的臺酚藍(lán)-PBS 100 μL，離心，去上清液，加 100 μL PBS溶解，測定熒光值，此值為表面熒光值。

巨噬細(xì)胞吞噬能力=吞噬及表面熒光總和-表面熒光值

1.6.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法） 將細(xì)胞懸液分兩孔加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200 mL，一孔加15 μL ConA液，另一孔作為對照，置質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔輕輕吸去上清液100 μL，同時(shí)加入MTT（5 mg/mL）20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。 培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 μL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570 nm波長測定光密度值。詳見文獻(xiàn)[14]。

受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.6.4 半數(shù)溶血值（HC50）測定 用生理鹽水將小鼠血清稀釋200倍，將稀釋后的血清1 mL置試管內(nèi)，依次加入10%體積分?jǐn)?shù)的SRBC 0.5 mL，補(bǔ)體1 mL（用SA液按1∶8稀釋）。另設(shè)不加血清的對照管（以SA液代替）。置37℃恒溫水浴中保溫15～30 min后，冰浴終止反應(yīng)。2 000 r/min離心10 min。取上清液1 mL，加都氏試劑3 mL，同時(shí)取10%體積分?jǐn)?shù)SRBC 0.25 mL加都氏試劑至4 mL，充分混勻，放置10 min后，于540 nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下式計(jì)算:

受試樣品組的HC50顯著高于對照組的HC50，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間差異比較用SPSS 10統(tǒng)計(jì)軟件作方差分析。

2 材料與方法

2.1 蘆筍乙醇提取物的成分分析

對風(fēng)干蘆筍乙醇提取物活性成分的測定結(jié)果見表1。可以看出，風(fēng)干蘆筍經(jīng)乙醇提取后，富含皂苷、多糖、總游離氨基酸等活性成分，表明乙醇提取能較好地富集蘆筍活性成分。

表1 蘆筍乙醇提取物中活性成分含量Table 1 Analysis of Ethanol extract active components from asparagus（X±S,n=3）

2.2 蘆筍乙醇提取物對小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響——非特異性免疫

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是評價(jià)機(jī)體非特異性免疫響應(yīng)的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)測定了不同劑量組蘆筍乙醇提取物對小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響，結(jié)果如表2所示。可以看出，蘆筍乙醇提取物低、中、高劑量組的處死前體重與空白對照組相比差異不顯著。對照組與蘆筍乙醇提取物低劑量組的脾指數(shù)相比差異不顯著，與中、高劑量組的脾指數(shù)相比差異均顯著，表明蘆筍乙醇提取物具有增值脾臟指數(shù)的作用，并且隨蘆筍皂苷劑量增加，脾臟指數(shù)呈增加的趨勢。蘆筍乙醇提取物中劑量組的胸腺指數(shù)與對照組相比差異極顯著，低、高劑量組的胸腺指數(shù)與對照組相比差異不顯著。表明蘆筍乙醇提取物對胸腺指數(shù)具有一定增加作用。

表2 蘆筍乙醇提取物對小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 2 Effects of asparagus ethanol extract on spleen index and thymus index of mice（X±S，n=12）

2.3 蘆筍乙醇提取物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響——非特異性免疫

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象，其吞噬功能可反映機(jī)體的非特異性免疫功能。實(shí)驗(yàn)測定了不同劑量組蘆筍乙醇提取物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。結(jié)果（表3）顯示，與對照組相比，蘆筍乙醇提取物能顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，70 mg/kg劑量組的腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能最強(qiáng)。說明蘆筍乙醇提取物有助于提高小鼠的非特異免疫功能。

2.4 蘆筍乙醇提取物對脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（MTT）——特異性免疫

當(dāng)T淋巴細(xì)胞受ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞通過線粒體水解酶將MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）分解為蘭紫色結(jié)晶而顯色，其光密度值能反映細(xì)胞的增殖情況[14]。實(shí)驗(yàn)測定了不同劑量組蘆筍乙醇提取物對脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果（表4）表明:經(jīng)口給予小鼠不同劑量蘆筍乙醇提取物30 d后，與空白對照組比較，70 mg/kg、140 mg/kg劑量組能顯著增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力（P＜0.01）。而7 mg/kg劑量實(shí)驗(yàn)組的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力未發(fā)生明顯變化（P＞0.05）。淋巴細(xì)胞在免疫調(diào)控中起重要作用，特異性免疫是由淋巴細(xì)胞識別外源性抗原開始，通過增殖和分化成效應(yīng)細(xì)胞行使清除抗原的功能。因此，淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)是反映淋巴細(xì)胞活化和功能的重要指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)說明一定劑量的蘆筍乙醇提取物能夠刺激淋巴細(xì)胞增殖的有絲分裂源活性，具有顯著增強(qiáng)其細(xì)胞免疫功能，并且隨蘆筍乙醇提取物劑量增加，淋巴細(xì)胞增殖能力呈增強(qiáng)趨勢。

表3 蘆筍乙醇提取物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Table 3 Effects of asparagus ethanolextract on macrophage phagocytosis （X±S，n=12）

表4 蘆筍乙醇提取物對脾淋巴細(xì)胞增值能力的影響Table 4 Effects of asparagus ethanol extract on spleen lymphocytes multiplication （X±S，n=12）

2.5 蘆筍乙醇提取物對半數(shù)溶血值 （HC50）的影響——特異性免疫

血清溶血素含量（HC50）可以反映B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后分化成漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體的能力，其含量與機(jī)體體液免疫能力呈正相關(guān)[17]。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同劑量組蘆筍乙醇提取物對半數(shù)溶血值（HC50）的影響。 結(jié)果（表 5）表明:低、中和高劑量組的半數(shù)溶血值HC50與空白對照組比較差異極顯著，低、中和高劑量組間的差異也極顯著，劑量與效應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系。表明蘆筍乙醇提取物能顯著提高溶血素的生成量，具有很強(qiáng)體液免疫調(diào)節(jié)功能。

表5 乙醇提取物對小鼠半數(shù)溶血值的影響Table 5 Effects of asparagus ethanol extract on HC50 （±S，n=12）

表5 乙醇提取物對小鼠半數(shù)溶血值的影響Table 5 Effects of asparagus ethanol extract on HC50 （±S，n=12）

注:compare with control，*P＜0.05；**P＜0.01；Production of hemolysin was indicated by HC50。

組別 劑量/（mg/kg） HC50對照組 - 148.85±2.18 7蘆筍提取物處理組167.08±9.90**70 268.26±7.59**140 390.83±15.87**

3 結(jié)語

用乙醇提取風(fēng)干蘆筍，可以得到蘆筍的多種活性成分，其主要包括蘆筍皂苷、蘆筍多糖和多種游離氨基酸。Gautam M等人[9]報(bào)道指出，蘆筍根水提取物可以顯著增加外周血CD3和CD4/CD8的百分比，降低其Th1/Th2比值；實(shí)驗(yàn)表明，蘆筍根水提物具有T淋巴細(xì)胞的活化作用。該研究針對蘆筍根水提取物對細(xì)胞亞群的免疫活性做了較深入分析。本實(shí)驗(yàn)對蘆筍乙醇提取物調(diào)節(jié)小鼠的非特異性和特異性免疫功能進(jìn)行了全面研究，結(jié)果顯示蘆筍乙醇提取物可以顯著增強(qiáng)脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力，極顯著提高血清溶血素含量，并具有劑量依賴性；同時(shí)，蘆筍乙醇提取物可顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，表明蘆筍乙醇提取物可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性來實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。以上結(jié)果表明，蘆筍乙醇提取物對小鼠的非特異性免疫功能和特異性免疫功能均有明顯的增強(qiáng)作用。

本實(shí)驗(yàn)首次以蘆筍的乙醇提取物為研究對象進(jìn)行其免疫功能研究，對于劑量的選擇是一個(gè)初步的探索，以推薦人劑量的1倍、10倍、20倍劑量作為小鼠灌胃劑量，劑量選擇的跨度相對較大，以此來探索蘆筍乙醇提取物的有效劑量區(qū)間，今后將在本次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上尋求蘆筍乙醇提取物發(fā)揮免疫功能作用的最佳劑量，并從細(xì)胞水平和分子水平展開蘆筍乙醇提取物調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)理方面的研究工作。

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