不同宿主來源的α-環糊精葡萄糖基轉移酶分離純化及化學修飾提高其熱穩定性

吳 丹， 鄭賢良， 吳 敬

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

環糊精葡萄糖基轉移酶或稱環狀淀粉轉移酶（Cyclodextrin Glycosyltransferas， 簡 稱 CGT 酶 ，EC2.4.1.19）是α-淀粉酶家族（家族13）中的重要成員，CGT酶是一種復合型的多功能酶，能催化4種不同的反應:環化反應、偶合反應和歧化反應3種轉糖基化反應以及水解反應[1]。環化反應是CGT酶所催化的特征性反應，是將從底物中酶解下來的低聚糖鏈自身首尾相連形成環糊精，環化反應是其工業應用的基礎[2]。

環糊精（Cyclodextrin，CD）是由環糊精葡萄糖基轉移酶通過環化反應將D-吡喃型葡萄糖單元以α-1，4-糖苷鍵連接而形成[2]。目前工業應用中最常見的環糊精為由6、7、8個葡萄糖單元構成的α-、β-、γ-環糊精。由于環糊精具有表面分布著眾多反應性羥基的外部親水結構，同時具有一個內部疏水性很強的疏水內腔，使其具有與表面活性劑相似的性質，在與許多種客體物質通過分子間相互可起到乳化劑的作用，形成主-客體包合物，比如無機分子、有機分子、絡合物甚至惰性氣體等，從而對客體物質具有活性保護、控制緩釋、包埋等功能；同時，利用環糊精空腔與客體分子大小的匹配性，也可以用于多種異構體分子的識別，制備大分子層析材料等。目前環糊精已經廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、農業、生物技術和分析化學等領域[3-4]。

在環糊精的酶法合成中，酶與底物的反應溫度一般是50～60℃，這就要求酶在50℃左右仍具有良好的穩定性。關于CGT酶熱穩定性研究方面，國內西北大學郭燕等[5]通過海藻酸鈉固定化CGT酶，對其穩定性進行了系統分析；田暉等通過在殼聚糖上對CGT酶進行固定化，使其熱穩定性和pH穩定性均有所提高[6]。自20世紀70年代末以來，有關用有機物進行蛋白質化學修飾的研究報道越來越多，化學修飾法也日益成為提高酶的穩定性的重要手段[7-8]。通過化學試劑特異性修飾酶分子的某個或某類氨基酸，可穩定蛋白質的構象，從而提高其耐熱性或其穩定性。在天然酶分子上接一些化學基團，可以得到多種多樣的修飾酶，只要選擇合適的修飾劑，利用化學修飾法可快速、廉價地提高酶的穩定性，甚至可合成新的酶種。

枯草芽孢桿菌是食品上允許使用的微生物，而大腸桿菌BL21（DE3）在誘導表達下具有很強的分泌表達能力[9-10]，本課題研究中采用了來源于野生型、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的3種不同宿主的α-CGT酶，進行分離純化得到純酶后再分析其熱穩定性的基礎上，研究采用戊二醛交聯的化學修飾對熱穩定性和酶活力造成的影響，以便為更好地工業化利用CGTase提供應用基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 表達α-CGT酶地野生型菌株P aenibacillus macerans、重組型菌株Bacillus subtilis WB600/pGJ103-CGT 和 Escherichia coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cgt均由作者所在實驗室保藏和構建。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨和酵母粉，購自Oxoid公司；標準分子量蛋白及SDS-PAGE試劑盒，購自碧云天生物技術研究所；其它試劑均為國產分析純。陰離子交換色譜填料Q-Sepharose和疏水色譜填料phenyl-Superose（HR10/10），購自美國 Amersham 公司。

1.1.3 儀器 紫外可見光分光光度計，日本Shimadzu公司產品；冷凍立式離心機（CF16RX），日本Hitachi公司產品；空氣恒溫搖床，上海精密儀器儀表有限公司產品；低壓層析系統及離子交換柱，上海層析設備廠產品；中空纖維膜超濾設備，AKTA蛋白純化系統，均為GE healthcare產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-CGT酶粗酶液的制備 搖瓶發酵來源于P.macerans，E.coli和 B.subtilis的 α-CGT 酶，將發酵液于4℃12 000 r/min離心20 min除菌體，收集培養物上清液。

1.2.2 蛋白質濃度的測定 采用Bradford法測定蛋白質濃度[11]，使用牛血清蛋白作為標準品。

1.2.3 α-CGT酶環化活力的測定 用甲基橙法測α-CGT酶的環化活力:將發酵液在4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。發酵上清液經適當稀釋后取100 μL加入裝有900 μL底物的5 mL的離心管中，底物為50 mmol/L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液配制的1 g/dL可溶性淀粉溶液，在40℃水浴保溫反應10 min，加入1 mL 1 mol/L的鹽酸終止反應，再加入磷酸鈉緩沖液配制的0.1 mmol/L甲基橙染色，于20℃保溫20 min，在505 nm測定吸光度。一個酶活單位（U）定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol的α-環糊精所需的酶量。

1.2.4 α-CGT酶的純化 采用AKTA蛋白純化系統對重組蛋白進行純化，整個純化過程控制溫度為4℃。離心收集含有重組α-CGT酶的發酵上清液，緩慢溶解加入終質量分數為70%的（NH4）2SO4沉淀蛋白質，4℃放置過夜，離心收集沉淀。用20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液復溶沉淀后，在20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中透析過夜，期間更換2～3次透析緩沖液。

裝柱，用10倍柱體積的20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液平衡陰離子交換柱Q-Sepharose；上樣，先用0.45 μm的微孔濾膜過濾樣品，將10 mL酶液用自動進樣器上樣，保持體積流量為1 mL/min；洗脫，用平衡緩沖液將未吸附到柱體上的蛋白質洗下來，洗脫體積為4～5個柱體積；吸附到柱上的蛋白質用含 0～1 mol/L KCl的 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液梯度洗脫，體積流量1 mL/min；收集目的蛋白質。

含α-CGT酶的組分在20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中透析過夜，緩慢加入終質量分數為 20%的固體（NH4）2SO4，用 10倍柱體積的內含質量分數 20%（NH4）2SO4的 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液平衡疏水柱phenyl-Superose（HR10/10）；1 mL/min上樣；吸附到柱上的蛋白質用質量分數 20%～0 的（NH4）2SO4的 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液反向梯度洗脫，體積流量1 mL/min。

含α-CGT酶的組分在50 mmol/L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中透析過夜（4℃），純化的重組α-CGT酶置于-80℃保存。

1.2.5 不同來源的純化α-CGT酶熱穩定性比較將蛋白質含量為0.4 mg/mL、pH為6.0的純化源于P.macerans，E.coli和 B.subtilis的 α-CGT 酶，置于50℃水浴30 min，每隔5 min取樣一次，測其殘酶活，比較其穩定性。

1.2.6 α-CGT酶的化學修飾 將純化的E.coli α-CGT酶用終質量分數為0.5%和1%的戊二醛進行交聯，向4 mL蛋白質含量為0.4 mg/mL的α-CGT酶液中加入質量分數25%的戊二醛，其終質量分數分別為0.5%和1%，在4℃交聯1 h，然后將交聯后的α-CGT酶在50 mmol/L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中透析過夜（4℃），去掉殘余的戊二醛，SDS-PAGE驗證其交聯度，50℃水浴30 min，每隔5 min取樣一次，測其殘酶活，比較其穩定性。

α-CGT酶粗酶制劑的交聯方法:先將粗酶液用終質量分數為70%的（NH4）2SO4沉淀蛋白質，4℃放置過夜，離心收集沉淀。然后加入質量分數為1%的戊二醛，對其進行交聯，將交聯后的α-CGT酶在50 mmol/L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中透析過夜（4℃），去掉殘余的戊二醛，50℃水浴30 min，測其穩定性。

2 結果與分析

2.1 不同來源的α-CGT酶的純化

作者所研究的α-CGT酶由野生型和兩種重組型的宿主分別表達，由于不同的宿主之間的生理代謝、蛋白質合成及修飾、蛋白質轉運過程各自不同，因此有可能導致所表達的酶的性質也有所不同。為了分析3種不同來源的α-CGT酶的性質，首先對其進行了分離純化研究。將E.coli，B.subtilis和P.macerans 3種來源的發酵上清液通過鹽析、QSepharose陰離子交換色譜和phenyl-Superose（HR10/10）疏水色譜純化α-CGT酶。純化結果見表1，純化后的蛋白質電泳圖見圖1。

表1 α-CGT酶的純化工藝Table 1 Purification scheme for α-CGTase

圖1 純化的α-CGT酶的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of the purification of α-CGTase

從表1可見，3種來源的α-CGT酶均得到了相對較高的回收率，SDS-PAGE證明了純化后酶蛋白的均一性，3種來源的α-CGT酶的比活相似，分別為 224.6 U/mg，211.5 U/mg和 233.8 U/mg。由此認為另外兩種宿主 E.coli，B.subtilis重組表達的 α-CGT酶的催化活性沒有受到宿主本身的影響。

2.2 不同來源的純化α-CGT酶的熱穩定性比較

將純化后的來源于 E.coli，B.subtilis和 P.macerans的α-CGT酶分別在50℃水浴30 min，每隔5 min取樣一次，測定其殘酶活，結果如圖2所示。

圖2 3種不同來源的純化α-CGT酶熱穩定性比較Fig.2 Thermal stability of purified E.coli，B.subtilis and P.macerans α-CGTase culture supernatant

由圖 2可見，純化后的來源于 E.coli，B.subtilis和P.macerans的α-CGT酶的熱穩定性稍有差別，50℃水浴30 min后，來源于E.coli的α-CGT酶還有21%的殘酶活，來源于B.subtilis的α-CGT酶還有28%的殘酶活，來源于P.macerans的α-CGT酶還有25%的殘酶活。因此來源于B.subtilis的熱穩定性較好，但差別不顯著。Jeang等[12]的研究認為可能是不同菌種周質空間中決定酶折疊的催化蛋白質種類不同造成了酶結構的細微差別，最終導致其穩定性的差異；Wulfing等[13]的研究也認為，蛋白質在周質空間中折疊獲得獨特的構象是由細胞的獨特生理環境所決定的，不同來源的同種蛋白質構象的差異或許可以反映不同細菌其細胞內環境的差異。但是，可以看出3種來源的α-CGT酶穩定性均不是很好，不能滿足工業化生產要求。考慮到E.coli的發酵產量遠遠高于B.subtilis和P.macerans，因此下面的研究采用E.coli發酵所產的α-CGT酶進行。

2.3 化學修飾對重組α-CGT酶穩定性的影響

在蛋白質的化學修飾中，交聯酶聚集體技術[14]是一種新型化學修飾方法，近幾年被劃分到無載體固定化酶范疇，是采用物理方法使酶分子聚集，再經交聯劑交聯而成。常用的交聯劑是戊二醛，其作用機理目前還未有準確合理的解釋，但其對酶的交聯效果已有報道，Yamazaki等[15]對葡萄糖脫氫酶進行交聯，發現經戊二醛交聯后可獲得耐熱性較好的交聯酶聚集體。因此作者擬研究液體純化α-CGT酶的戊二醛交聯以提高其穩定性。

重組酶的化學修飾具體方法如材料與方法中所述。用終質量分數為1%的戊二醛對α-CGT酶進行交聯，4℃反應1 h，用pH 6，50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液透析過夜，除去殘留的戊二醛，并用SDSPAGE檢驗交聯效果，見圖3。結果顯示，大部分α-CGT酶被成功交聯成大分子，并聚集在SDS-PAGE的頂端。

對其熱穩定性進行分析，將交聯與未交聯的α-CGT酶置于50℃水浴30 min，結果如圖4所示。可知，α-CGT酶交聯后相比于未交聯的α-CGT酶在50℃其熱穩定性有所提高。交聯酶置于50℃水浴30 min后，仍有78%的酶活，而未交聯的α-CGT酶僅剩20%的殘酶活。但該過程存在一個缺點，就是交聯后的α-CGT酶其酶活損失過大，交聯后的α-CGT酶與原酶液相比，僅剩20%的殘酶活。有可能是戊二醛濃度過高，導致酶失活，因此考慮降低戊二醛的濃度，研究α-CGT酶的交聯。

圖3 戊二醛（1%）交聯α-CGT酶的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of cross-linking α-CGTase

圖4 戊二醛（1%）交聯α-CGT酶與重組α-CGT酶的熱穩定性Fig.4 Thermal stability of cross-linking α-CGTase and recombinant α-CGTase

采用終質量分數為0.5%的戊二醛對純化α-CGT酶進行交聯，方法同質量分數1%的戊二醛交聯方法，SDS-PAGE檢測交聯效果，如圖5所示?？梢?，質量分數為0.5%的戊二醛交聯效果與質量分數為1%的戊二醛交聯效果差不多，大部分α-CGT酶被成功交聯成大分子，聚集在SDS-PAGE的頂端，但仍有部分游離的α-CGT酶。

將交聯與未交聯的α-CGT酶置于50℃水浴30 min，結果如圖6所示?？芍媒K質量分數為0.5%的戊二醛對α-CGT酶交聯后與用終質量分數為1%戊二醛交聯的α-CGT酶在50℃的熱穩定性基本一致，與未交聯的α-CGT酶相比明顯提高。交聯后的α-CGT酶還有50%的酶活，與用終質量分數1%的戊二醛交聯相比其酶活保留率有所提高，仍然存在交聯過程中酶活損失過大的問題，但可以肯定的是α-CGT酶的戊二醛交聯能夠明顯提高其熱穩定性。作者還繼續進行了質量分數0.25%戊二醛來交聯α-CGT酶的穩定性研究實驗，但是由于0.25%質量分數的戊二醛交聯效果較差，導致交聯前后α-CGT酶的穩定性幾乎沒有變化。

圖5 戊二醛（0.5%）交聯α-CGT酶的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of cross-linking α-CGTase

圖6 戊二醛（0.5%）交聯α-CGT酶與重組α-CGT酶的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of cross-linking α-CGTase and recombinant α-CGTase

3 結語

作者在實驗室前期工作實現了α-CGT酶高效表達的基礎上，針對重組酶存在的穩定性問題開展研究。發現3種不同來源的α-CGT酶的酶活和熱穩定性差別不大，對E.coli重組表達的α-CGT酶首次采用戊二醛進行交聯修飾，將α-CGT酶交聯成大分子后，50℃水浴30 min仍有78%的酶活，而未交聯的α-CGT酶僅剩20%的殘酶活，交聯后酶活保有率提高了2.9倍。雖然由于交聯的無序性，導致較多的酶活性中心可能受到修飾而降低了酶活力，但是化學修飾卻可以明顯提高酶的熱穩定性，為下一步大規模開發α-CGT酶工業應用奠定了良好的基礎。此外，為了更精確地控制生物催化劑的性能，仍然需要開發更加特異性的修飾方法。如建立在準確了解蛋白質的結構和功能關系上的酶的化學修飾法與基因工程技術相結合的酶的定向修飾技術，或許是值得嘗試的方法之一。

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