原料乳中產(chǎn)耐熱蛋白酶細(xì)菌的鑒定及其酶學(xué)特性研究

張 熙， 母智深

（1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州510006；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

熒光假單胞菌是低溫冷藏原料乳中常見的一類細(xì)菌[1]，其種類繁多，廣泛存在于低溫環(huán)境中。已經(jīng)了解的嗜冷菌中，細(xì)菌就有30多個(gè)屬，其中屬于革蘭氏陰性的Pseudomoas屬和革蘭氏陽(yáng)性Bacillus屬的較多[2]。而原料乳中以兼性嗜冷菌為主，從原料乳中分離到的嗜冷菌以假單胞菌屬（Pseudomonas），特別是熒光假單胞菌（P.fluorescens）居多。產(chǎn)生熱穩(wěn)定性蛋白酶和脂肪酶的主要是假單胞菌屬[3]，這類菌增長(zhǎng)速度快，在2℃條件下仍能生長(zhǎng)良好[4]。該類細(xì)菌其本身不耐熱，一般巴氏殺菌條件可以將其殺死，但它們分泌的胞外耐熱性蛋白酶可以耐受UHT殺菌條件（140℃，4 s）。該類蛋白酶經(jīng)常引起UHT乳及其它乳制品在貨架期內(nèi)發(fā)生水解、凝塊、變苦等品質(zhì)劣變現(xiàn)象[5]。

研究中從原料乳中分離得到一株產(chǎn)耐熱蛋白酶的嗜冷細(xì)菌，采用多項(xiàng)鑒定方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定。在此基礎(chǔ)上研究耐熱蛋白酶的部分酶學(xué)特性和耐熱性。為在乳品工業(yè)中如何控制以及耐高溫蛋白酶將來利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 產(chǎn)耐高溫蛋白酶菌株分離與篩選

1.1.1 嗜冷菌分離 原料乳取自內(nèi)蒙古呼和浩特市周邊奶站。原料乳用劃線法直接涂布于固體培養(yǎng)基[6-7]（胰蛋白胨 5 g/L，酵母浸膏 2.5 g/L，葡萄糖 1 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.2），6.5℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d。挑取單個(gè)菌落，觀察菌落大小、形狀、色澤、色素產(chǎn)生、表面光滑程度、邊緣整齊度。選取形態(tài)差異的菌落，結(jié)合革蘭氏染色進(jìn)行嗜冷菌篩選。平板上劃線純化2~3次后得到純培養(yǎng)物。

1.1.2 嗜冷菌篩選 將分離純化的嗜冷菌菌株分別接種于1.0 g/dL的酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上置于20℃培養(yǎng)5 d。選擇水解圈大而明顯的菌株，進(jìn)一步純化并保存。將產(chǎn)生水解圈的菌株，接入50 mL上述液體培養(yǎng)基中，20℃，培養(yǎng)48 h，然后取5 mL接種到100 mL相同液體培養(yǎng)基中，于20℃條件下，搖床（120 r/min）培養(yǎng)5 d。將發(fā)酵液在15 000 g條件下低溫（4℃）離心20 min，上清液即為胞外蛋白酶粗酶液。分別測(cè)定上清液酶活和經(jīng)過95℃，5 min加熱后酶的剩余活力。根據(jù)上述兩項(xiàng)指標(biāo)選擇一株目標(biāo)菌株。

1.2 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

將入選菌株劃線于上述固體培養(yǎng)基，在20℃下培養(yǎng)2 d，觀察其菌落形態(tài)；并在電子顯微鏡下觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第九版）》[8]和《工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》[9]。

全細(xì)胞脂肪酸分析采用GC-MS[10]。2 000 mL的錐形瓶盛1 000 mL滅菌NB培養(yǎng)液。按體積分?jǐn)?shù)5%接種，20℃搖床（120 r/min）培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)菌液于5 000 g離心15 min。棄去上清液。沉淀菌體用超純水洗滌3次。取出菌體約400 mg（濕重）細(xì)胞移入有Teflon蓋的試管中。向樣品管中加入體積分?jǐn)?shù)15%NaOH－甲醇10 mL，100℃水浴30 min，然后加入體積分?jǐn)?shù)25%HCL-甲醇20 mL，水浴80 ℃，10 min，冷卻后分別加入10 mL的水和乙醚提取細(xì)胞脂肪酸甲酯（FAMEs），將乙醚提取物用氮?dú)饬鞔蹈桑尤?00 μL正己烷溶解。取2 μL正己烷作GC-MS分析。

1.3 16S及16S-23S rDNA間區(qū)的PCR擴(kuò)增及分析

細(xì)菌基因組DNA的提取見參考文獻(xiàn)[11]。引物采用革蘭氏陰性細(xì)菌通用引物，由大連寶生物公司提供，引物序列見表1、表2。

表1 16S rDNA PCR擴(kuò)增引物Table 1 16S rDNA sequencing primers used in PCR

表2 16-23S rRNA擴(kuò)增引物Table 2 16S-23S rRNA sequencing primers used in PCR

PCR反應(yīng)見文獻(xiàn)[12-14]。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast后交送GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列對(duì)比，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 蛋白酶催化溫度和pH確定及耐熱性研究

1.4.1 蛋白酶最適作用溫度 將蛋白酶與底物溶液（偶氮酪蛋白）混合，分別置于 20，25，35，40，45℃和50℃下反應(yīng)2 h，測(cè)定蛋白酶活力。

1.4.2 蛋白酶最適作用pH確定 配置pH值范圍在4.6到10.6的多種緩沖溶液，pH值間隔為0.5。其中乙酸-乙酸鈉緩沖液 pH 4.6～5.8，磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液 pH 6.0～7.0，Tris-HCl緩沖液 pH 7.2～8.8，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 pH 9.0～10.6。 用上述緩沖液分別代替Tris-HCl（pH 7.5）緩沖溶液，測(cè)定蛋白酶活力。

1.4.3 酶熱穩(wěn)定性測(cè)定 取60 μL酶液，置于4 mm×40 mm密封玻璃管中，用油浴加熱。熱電偶置于另一玻璃管中，測(cè)定酶液加熱到指定溫度所需的時(shí)間。 加熱溫度分別為 80，90，100，110，120，130 和140℃，酶受熱時(shí)間4 s。酶液加熱結(jié)束后，將玻璃管置于20℃水中快速冷卻。取熱處理后酶液40 μL，測(cè)定蛋白酶剩余活力。

1.5 酶活力測(cè)定方法

以偶氮酪蛋白（azocasein）為底物，測(cè)定蛋白酶水解活性[15]。先將酶溶液，底物，緩沖液在40℃水浴中預(yù)熱，然后將 1 250 μL 酶溶液（pH 7.5，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液稀釋）添加到1 750 μL偶氮酪蛋白溶液中（1.5 g/dL），40℃水浴2 h后，加入 3 000 μL 10 g/dL三氯醋酸中止反應(yīng)。混合物立即在4℃下離心（10 000 g，10 min），取 2 400 μL 上清液，用600 μL 1.8 mol/L NaOH溶液中和，在420 nm處測(cè)定其吸光度值。1個(gè)酶活力單位（unit）定義為：在上述實(shí)驗(yàn)條件下，2 h內(nèi)，每毫升酶液，每增加0.01個(gè)OD420nm定義為1個(gè)酶活力單位。酶活力計(jì)算公式為：酶活（U/mL）=OD420nm×100×K/V。 其中 U 為酶活力單位，OD420nm為420 nm下酶的吸光度值，K為酶的稀釋倍數(shù)，V為酶液量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用軟件SSPS12.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)來自最少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，并各重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在培養(yǎng)基上，被選菌株菌落呈現(xiàn)淡白色圓形，表面光滑，邊緣整齊。從透射電鏡的照片（圖1，圖2）可以看出，該菌株為桿菌，大小為0.6 μm×2.0 μm，無菌柄也無鞘，不產(chǎn)芽孢，有鞭毛，且鞭毛數(shù)大于1。依菌株的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)，可以初步判定該菌歸屬于熒光假單胞菌，并編號(hào)Rm12。

2.2 生理生化鑒定

生理生化特征鑒定見表3。該菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，產(chǎn)熒光色素，不產(chǎn)非熒光色素，產(chǎn)果聚糖，反硝化實(shí)驗(yàn)陰性，卵磷脂酶，脂酶陽(yáng)性，能在4℃下生長(zhǎng)，41℃不生長(zhǎng)。其大部分生理生化特性與熒光假單胞菌（P.fluorescens）最為接近。

菌株Rm12的細(xì)胞脂肪酸（CFAs）分析結(jié)果見表4。其中具有鑒別意義的脂肪酸分別是3-羥基癸酸（C10：0）、2-羥基月桂酸（C12：0）、3-羥基月桂酸（C12：0）、肉豆寇酸（C14：0）、棕櫚油酸（C16：1）、反式棕櫚油酸（C16：1）、棕櫚酸（Cl6：0）、油酸（C18：1）、反油酸（C18：1）和 硬脂酸（C18：0）。Rm12不僅含有假單胞菌所共有的飽和脂肪酸 C16：0，及不飽和脂肪酸 C16：1及 C18：1，同時(shí)也含有被認(rèn)定假單胞桿菌的特征脂肪酸的 C10：03OH和 C12：03OH。

圖1 菌株Rm12的電鏡掃描圖片F(xiàn)ig.1 TEM micrograph of Rm12 cell

2.3 分子鑒定

2.3.1 16S鑒定結(jié)果

用革蘭氏陰性細(xì)菌通用引物擴(kuò)增菌株Rm12的16S rDNA基因，獲得1 455 bp的片段，并測(cè)序。采用NCBI網(wǎng)站中的Blast工具，將菌株Rm12的16S rDNA基因序列與GenBank中查得的相關(guān)序列進(jìn)行比較，得到與其序列同源性較高的相關(guān)菌株的16S rDNA序列，采用CLUSTALX 1.8軟件對(duì)所測(cè)定的核苷酸序列進(jìn)行排列，用系統(tǒng)發(fā)育推斷軟件包PHYLIP 3.5 c中的距離依靠法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，Rm12菌株與假單胞菌屬（Pseudomonas）一些種的序列同源性高。與AM410618，DQ279328，DQ279327的最大相似度高達(dá)100%。與AY747594，AM411619，DQ219372，DQ200857，DQ314540，DQ31 4541，DQ200851，DQ314546 的相似度高達(dá) 99%，除AY747594被鑒定為P.reactans，其它菌株均被鑒定為假單胞桿菌的變種。因此，從分子分類學(xué)的角度來看Rm12菌株屬于假單胞菌屬的菌種。

圖2 菌株Rm12多個(gè)菌體電鏡掃描圖片F(xiàn)ig.2 TEM micrograph of Rm12 cells

表3 Rm12菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical character of Rm12

圖3 根據(jù)16S rDNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Rm12 based on 16s rDNA

2.3.2 16-23S rRNA間區(qū)鑒定結(jié)果 通過對(duì)Rm12菌株的16S-23S rRNA間區(qū)序列測(cè)定，獲得1056 bp基因片段。將菌株Rm12的16S-23S rRNA間區(qū)序列與GenBank中查得的相關(guān)序列進(jìn)行比較。結(jié)果是，Rm12菌株與假單胞菌屬（Pseudomonas）中的熒光假單胞桿菌（P.fluorescens）的一些菌株的序列同源性較 高 。 該 菌 株 與 AF127587.1，AF127586.1，AF127585.1的最大相似度高達(dá)100%，與AY582369.1，AY582380.1，AY582371.1 的相似度也高達(dá)99%，與其它菌株的最大相似度均達(dá)到了95%以上。因此，從分子分類學(xué)的角度進(jìn)一步確定Rm12菌株屬于熒光假單胞桿菌。

圖4 根據(jù)16-23S rRNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Rm12 based on 16～23S rRNA

2.4 蛋白酶的最適溫度和最適pH

在不同溫度下測(cè)定蛋白酶活力。結(jié)果（圖5）表明，該酶的最適反應(yīng)穩(wěn)定為40℃，活力達(dá)到5 403 U/mL，酶的溫度影響曲線并不對(duì)稱，低于最適溫度時(shí)，酶活力上升較為平緩，高于最適溫度時(shí)，酶活力下降相對(duì)較快。

不同pH下蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果（圖6）表明，該酶的最適pH為7.5。在pH值低于7.5或高于7.5時(shí)，酶活力下降的速度較快。

圖5 不同溫度對(duì)蛋白酶的影響Fig.5 Effect of temperature on the protease

圖6 不同pH對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.6 Effect of pH value on protease

2.5 酶的熱穩(wěn)定性

原 酶液 在 80，90，100，110，120，130 和 140 ℃條件下加熱4 s，測(cè)定剩余活力。見圖7，從80℃到140℃，隨著溫度升高，酶的活力呈明顯下降趨勢(shì)。原酶液在140℃下加熱4 s，剩余活力為321.55 U/mL。剩余活力為原酶液活力的6.66%。

圖7 酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定Fig.7 Effect of high temperature on the protease

3 討論

根據(jù)形態(tài)鑒定，生理生化特性，菌體脂肪酸含量和種類測(cè)定，16S rDNA及16-23S rRNA區(qū)間基因序列分析，從原料乳中分離得到的菌株Rm12屬于熒光假單胞菌（P.fluorescens）。

脂肪酸是微生物細(xì)胞組分中一種較為穩(wěn)定的重要成分，它和細(xì)菌的遺傳變異、毒力、耐藥性等有極為密切的關(guān)系，它的種類和含量是細(xì)胞化分類法的重要依據(jù)之一。Gundlapalli[16]等人分離的嗜冷假單 胞 桿 菌 CMS35T，CMS38T 和 CMS64T 中 ，C16：0，C16：1， 和 C18：1均 為 它 們 的 主 要 脂 肪 酸 。 1987 年Ikemoto等人研究了50株不同假單胞桿菌，所有菌株中都存在直鏈的飽和脂肪酸C16：0，及不飽和脂肪酸 C16：1及 C18：1。Vancaneyt的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)。 C10：03OH和 C12：03OH被作為假單胞桿菌的特征脂肪酸[17]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，Rm12不僅含有假單胞菌所共有的飽和脂肪酸C16：0，及不飽和脂肪酸C16：1及C18：1，同時(shí)也含有被認(rèn)定假單胞桿菌的特征物質(zhì)的 C10：0 3OH 和 C12：0 3OH。

大多數(shù)耐熱蛋白酶作用最佳溫度多數(shù)在60～80℃之間，少數(shù)例外也在80℃以上[18-19]。而作者所分離得到的蛋白酶最適溫度在40℃，與常規(guī)耐熱蛋白酶的情況不一致，這可能與該蛋白酶的分子結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。pH值對(duì)酶反應(yīng)的影響是多方面的，通過影響酶的構(gòu)象和底物的荷電性質(zhì)，從而影響酶的活性中心與底物的接近和結(jié)合程度。酶是一種兩性化合物，在不同的pH下會(huì)以不同的解離狀態(tài)存在，往往只有一種解離狀態(tài)最適合酶促反應(yīng)的進(jìn)行，這就是最適pH值。此外，pH值還會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，極端pH值下能夠?qū)е旅傅牟豢赡孀冃浴?/p>

4 結(jié)語(yǔ)

通過以上分析，從原料乳中分離的菌株Rm12屬于熒光假單胞桿菌（P.fluorescens），是一種產(chǎn)耐熱蛋白酶的嗜冷菌。該菌所產(chǎn)的耐熱蛋白酶可以耐受一般UHT滅菌條件 （140℃，4 s）。

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