食用鼠曲草黃酮的提取及體外抗氧化性研究

石青浩， 李 榮， 姜子濤

（天津商業(yè)大學 生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134）

鼠曲草（Gnaphlium affine）俗稱清明菜、追骨風、佛耳草，為菊科植物鼠曲草的全草，主要分布于我國華東、華中、華南、西南、西北、華北及臺灣，以野生為主，可藥用也可食用。全草含鈣、鉀、鎂等微量元素，還含有氨基酸、黃酮類化合物、揮發(fā)油、豆甾醇、生物堿等[1-4]。具有降血脂、降血糖、降血壓、抗衰老、消炎抑菌、增強免疫力等多種功效[5]。

文中探討了微波提取鼠曲草黃酮的條件，并對微波提取的鼠曲草黃酮與抗氧化劑VC進行了體外抗氧化性能和清除自由基性能的比較研究，為鼠曲草資源在食品、保健品等領域的進一步開發(fā)利用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠曲草，安徽誠信藥家有限公司提供；S-8大孔吸附樹脂，購于南開大學化工廠；水（娃哈哈飲用純凈水），杭州娃哈哈集團有限公司出品；蘆丁標準品（分析純），北京化學試劑公司產(chǎn)品；DPPH:美國Sigma公司產(chǎn)品；抗壞血酸（VC）、結(jié)晶紫、磷酸鈉、鉬酸銨等均為分析純，所用水為除氧蒸餾水。其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

MAS-Ⅰ型微波快速制樣系統(tǒng)，上海新儀微波化學科技有限公司制造；U-3900 UV-Vis紫外可見分光光度計，日本日立公司制造；LGJ-10型冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司制造；KQ2200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司制造；FA1104N型電子天平，上海精密儀器有限公司制造；RE 52-86A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠制造；80-1型離心機，上海手術(shù)器械廠制造；電熱恒溫水浴鍋，北京市長風儀器儀表公司制造；970CRT熒光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司制造；LRH-150S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠制造。

2 試驗方法

2.1 鼠曲草總黃酮的微波提取工藝

稱取2.0 g鼠曲草粉末，固定微波功率500 W，以體積分數(shù)60%乙醇溶液為溶劑，放入微波玻璃反應器中，按 1∶60（g/mL）的料液比在 60℃下萃取 5 min，待提取液稍冷后進行過濾，濾液經(jīng)石油醚萃取，去掉石油醚層，得鼠曲草黃酮的提取液，再經(jīng)旋蒸后冷凍干燥，得到鼠曲草黃酮粉末。

試驗以黃酮得率為指標，通過單因素試驗來確定在固定微波功率為500 W下的乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間和溫度等因素的試驗范圍，以得到微波輔助提取鼠曲草黃酮的最佳工藝參數(shù)。

2.2 黃酮含量的測定

首先以蘆丁為標準品，采用比色法[6]，確定蘆丁濃度c與吸光度A之間的標準工作曲線，A=13.09c+0.003，相關系數(shù)R2=0.999 8。然后，取2.0 mL黃酮提取液，同樣按照文獻[6]的方法進行顯色后，以試劑空白作參比測定吸光度值，利用標準工作曲線計算出鼠曲草黃酮的得率（為從鼠曲草粉末中所提取的黃酮的質(zhì)量與鼠曲草粉末質(zhì)量之比）。

2.3 總抗氧化活性的測定－磷鉬絡合物法

取0.1 g鼠曲草黃酮粉末，用體積分數(shù)30%乙醇溶解定容到100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的鼠曲草黃酮儲備液，用時用體積分數(shù)30%乙醇溶液稀釋到所需濃度，配制VC溶液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL作儲備液。將儲備液分別稀釋成質(zhì)量濃度為 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL 的黃酮溶液和VC溶液的樣品液。由終濃度為0.6 mol/L硫酸、4.0 mmol/L鉬酸銨和28.0 mmol/L磷酸鈉的溶液配制成磷鉬試劑。取4.0 mL磷鉬試劑液和0.4 mL樣品溶液于一系列10 mL的比色管中，迅速搖勻后在95℃水浴中恒溫90 min。在695 nm波長下測定不同濃度樣品溶液的吸光度A。平行測定3次，取平均值。方法詳見文獻[7-8]。

2.4 清除羥基自由基能力的測定－結(jié)晶紫法

將儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的鼠曲草黃酮溶液和VC溶液為樣品液。取0.5 mL結(jié)晶紫 （0.4 mmol/L）、0.7 mL H2O2溶液 （5.0 mmol/L）和0.7 mL FeSO4溶液 （10.0 mmol/L）于一系列10 mL的比色管中。用磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液的緩沖溶液（pH 4.0）定容至 10.0 mL，搖勻并放置 30 min，在580 nm波長下測其吸光度Ab，同時測定不加雙氧水時580 nm波長處的吸光度A0。羥自由基的產(chǎn)生量可以用△A=A0-Ab表示。方法詳見文獻[9]。

樣品液對羥自由基清除率的測定:按照上述步驟在加 H2O2之前分別加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的樣品液，測定其吸光度As，平行測定3次，取平均值。則樣品溶液對羥自由基的清除率S為

2.5 清除超氧陰離子自由基能力的測定－鄰苯三酚自氧化熒光動力學法

將儲備液配制成質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5、1.0 mg/mL的黃酮溶液和VC溶液為樣品液。方法詳見文獻[10]。

2.5.1 光譜條件的選擇 向1 cm的石英比色皿中加入 2.2 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）、0.1 mL 水和0.3 mL鄰苯三酚（0.01 mol/L），混勻后立即掃描。設定靈敏度為2，Ex、Em縫寬為20，固定發(fā)射波長Em=508 nm，每隔兩分鐘在Ex=250～500范圍內(nèi)快速掃描，得到鄰苯三酚隨時間變化而變化的激發(fā)光譜。重新取液，固定激發(fā)波長Ex=444 nm，在Em=450～700 nm范圍內(nèi)每隔2 min掃描，得到鄰苯三酚隨時間變化的發(fā)射光譜。

2.5.2 鄰苯三酚自氧化反應速率的測定 向1 cm的石英比色皿中加入2.2 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）、0.1 mL 樣品液和 0.3 mL 鄰苯三酚（0.01 mol/L），混勻后在激發(fā)Ex=444 nm和發(fā)射Em=508 nm的波長條件下測定。利用3～7 min（每隔1 min測定值）以時間為橫坐標、相對熒光強度為縱坐標作圖，斜率為Vs（以0.10 mL水代替樣品溶液得到V0），即鄰苯三酚自氧化的反映速率。按下式計算抑制劑對O2-·的抑制率V為

2.6 清除DPPH自由基的測定

將儲備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的鼠曲草黃酮溶液和VC溶液為樣品液。取3.5 mL濃度為1×10-4mol/L的DPPH溶液和0.5 mL樣品液于10 mL的比色管中，搖勻并放置30 min，倒入1 cm的石英比色皿，測定517 nm下的吸光度A。以3.5 mL DPPH溶液和0.5 mL體積分數(shù)30%乙醇溶液的混合液為參比，測定517 nm下的吸光度A1。同樣方法測定3.5 mL無水乙醇和0.5 mL樣品液混合后在517 nm下的吸光度A0，平行測定3次，取平均值。則樣品液對DPPH自由基的清除率為

方法詳見文獻[11]。

2.7 Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過不飽和脂肪酸（PUFA）過氧化體系中抗氧化活性（AOA）的測定

將儲備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2和0.3 mg/mL的鼠曲草黃酮溶液和VC溶液為樣品液。卵黃懸濁液用卵黃和等體積的pH=7.45、濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PB）配成體積比1∶1的懸濁液，磁力攪拌10 min，再用PB稀釋成體積比1∶25的懸液置于冰箱中備用。取0.2 mL體積比1∶25的卵黃懸濁液、0.2 mL的25.0 mmol/L FeSO4溶液和0.2 mL樣品液于一系列10 mL離心管中，用PB補充至2.0 mL，37℃培養(yǎng)24 h，取出后加入0.5 mL質(zhì)量分數(shù)20%的三氯乙酸溶液（TCA）搖勻，10 min后再加入1.0 mL質(zhì)量分數(shù)0.8%的硫代巴比妥酸溶液（TBA），置于沸水浴15 min，冷卻后以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，在532 nm波長下測定吸光度值A；對照管除不加樣品液外，其它試劑同前，所測吸光值為A0，平行測定3次，取平均值。空白管以2.0 mL PB代替，則樣品溶液對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制率為

方法詳見文獻[12]。

3 結(jié)果與討論

3.1 鼠曲草黃酮微波提取條件的優(yōu)化

按方法2.1進行提取，固定其他條件，分別測定在不同料液比、提取時間、提取溫度和乙醇體積分數(shù)下的鼠曲草黃酮得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 料液比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of the ratio of material to liquid，time，temperature and ethanol concentration on flavones extraction

由圖1可以看出，隨著提取液比例的增大，黃酮提取量不斷升高，當料液比達到1∶60時達到最高，之后黃酮得率有所下降。這是由于鼠曲草全株密被白綿毛的特點，隨著提取液比例的增大，浸潤程度增大，同時根據(jù)分散劑由高濃度向低濃度擴散原理，增大提取液比例也會增進黃酮的析出。但液料比過大的時候，會影響到物料對微波能的吸收，導致黃酮得率下降，故選擇提取鼠曲草黃酮的料液比為1∶60。提取時間的延長促使黃酮提取量逐漸增加，在6 min處達到最大，之后保持穩(wěn)定，因此選擇6 min為鼠曲草黃酮提取的最優(yōu)時間。在微波處理溫度小于60℃時，隨著溫度的增加，總黃酮提取得率也隨著增加，并在60℃時達到最大值；在微波處理溫度大于60℃以后，過高的溫度會使提取物部分分解或變性，同時雜質(zhì)溶出量增加，提取率會明顯減小[13-14]。故微波處理溫度以60℃為宜。黃酮甙是由黃酮甙元與糖基構(gòu)成，黃酮甙元極性較小，糖基極性較大，故黃酮甙是中等極性的物質(zhì)。根據(jù)“相似相溶”原則，黃酮甙易溶于中等或中等偏上極性的溶劑中。乙醇體積分數(shù)超過50%時，極性相對偏低，黃酮甙的溶解度也降低。并且乙醇體積分數(shù)較高會使細胞蛋白質(zhì)很快就凝固，不利于乙醇向細胞內(nèi)滲透[15]。因此，本實驗中選50%體積分數(shù)的乙醇作為提取溶劑。

3.2 總抗氧化活性

根據(jù)實驗方法2.3，測定樣品和VC不同質(zhì)量濃度下的吸光度，得到其抗氧化活性強弱，結(jié)果見圖2。

圖2 樣品液終質(zhì)量濃度與吸光度的關系Fig.2 Relationship of final concentrations of samples and absorbance

由圖2可以看出，樣品的吸光度隨質(zhì)量濃度的增加而增加，說明質(zhì)量濃度越大，其抗氧化性就越強。與抗氧化劑VC相比，兩倍量的鼠曲草黃酮的總抗氧化能力約等于一倍量VC的總抗氧化能力。

3.3 清除羥自由基的能力

根據(jù)實驗方法2.4，得到樣品和VC在不同質(zhì)量濃度下的吸光度，根據(jù)公式（1）計算對羥自由基的清除率，結(jié)果見圖3。

圖3 樣品液終質(zhì)量濃度與羥自由基清除率的關系Fig.3 Relationship between sample concentration and hydroxyl radical scavenging

從圖3可以看出，樣品液對羥自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的升高而變大，同質(zhì)量濃度下，鼠曲草黃酮對羥自由基的清除能力遠遠大于VC。

3.4 清除超氧陰離子自由基的能力

參照試驗方法2.5.1，掃描鄰苯三酚自氧化隨時間變化的激發(fā)與發(fā)射光譜，結(jié)果見圖4。

圖4 鄰苯三酚的激發(fā)光譜（左）和發(fā)射光譜（右）Fig.4 Excitation spectra （left） and emission spectra（right） of pyrogallol

實驗表明，鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物的熒光強度隨時間逐漸增大，從而得到熒光強度與時間的線性關系，直線的斜率為鄰苯三酚自氧化速率V0。鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為444 nm和509 nm。

參照試驗方法2.5.2進行測定，得出樣品液對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物的影響結(jié)果，見圖5。

圖5 黃酮（a）和Vc（b）熒光動力學曲線Fig.5 Curve of fluorescent kinetic of flavones（a） and Vc（b）

從圖5可以看出，樣品液的質(zhì)量濃度越大則曲線斜率越小，表明樣品液對鄰苯三酚自氧化的抑制作用越強。按公式（2）計算得到樣品液在不同質(zhì)量濃度下對超氧自由基（O2-·）的抑制率，見表1。

表1 樣液對超氧自由基（O2-·）的抑制率Table 1 Inhibitory rate of sample concentration on superoxidic radicals

實驗表明，鼠曲草黃酮在低質(zhì)量濃度時對超氧自由基（O2-·）的作用不明顯，但當升高其質(zhì)量濃度時，其抑制力明顯增強。

3.5 對DPPH自由基的清除能力

根據(jù)方法2.6，按照公式 （3）計算樣品液對DPPH自由基的清除率，結(jié)果見圖6。

圖6 樣品液終質(zhì)量濃度和DPPH自由基清除率的關系Fig.6 Relationship between sample concentration and DPPH radical scavenging

由圖6可以看出，隨著樣液質(zhì)量濃度的增大清除率也隨之增大，當鼠曲草黃酮樣液終質(zhì)量濃度達到1.25×10-3mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到81.77%，略低于同質(zhì)量濃度的VC。

3.6 對Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過氧化的抑制作用

按照實驗方法2.7，得到黃酮溶液和VC溶液在不同質(zhì)量濃度下的吸光度，根據(jù)公式（4），計算出樣品液對Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過氧化的抑制率，結(jié)果見圖7。

圖7 樣品液終質(zhì)量濃度對Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過氧化的抑制率的影響Fig.7 Inhibition effect of sample concentration on the peroxidation of yolk lipoprotein induced by Fe2+

由圖7可以看出，隨著樣液質(zhì)量濃度的增加，對于Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過氧化的抑制率逐漸增強，當黃酮溶液終質(zhì)量濃度達到2.4×10-2mg/mL時清除率達到76.80%，高于同質(zhì)量濃度的VC。

4 結(jié)語

通過實驗得出微波功率固定為500 W時，微波提取的最佳工藝為:乙醇體積分數(shù)50%，料液比1∶60，溫度60℃，時間6 min，在此條件下得到的最高黃酮得率為4.63%。鼠曲草黃酮在總抗氧化能力、清除超氧陰離子自由基的能力、清除DPPH自由基的能力略低于抗氧化劑VC，但在清除羥自由基的能力和抑制Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過氧化的能力上鼠曲草黃酮強于VC。結(jié)果表明，鼠曲草黃酮是一種很好的天然抗氧化劑，本實驗結(jié)果為鼠曲草植物的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

[1]史虞花，司民真.鼠曲草的紅外光譜分析[J].光散射學報，2009，21（4）:366-370.SHI Yu-hua，SI Min-zhen.Comparison of FT-IR spectra of cudweed herb[J].The Journal of Light scattering，2009，21（4）:366-370.（in Chinese）

[2]呂晴，秦軍，陳桐，等.氣相色譜-質(zhì)譜法分析鼠曲草揮發(fā)油化學成分[J].貴州工業(yè)大學學報，2008，37（5）:1-3，10.LV Qin，QIN Jun，CHEN Tong，et al.GC-MS analysis of chemical components in volatile oil from the gnaphlium affine D.Don[J].Journal of Gui Zhou University of Technology，2008，37（5）:1-3，10.（in Chinese）

[3]潘明，王世寬，郭脈璽，等.鼠曲草黃酮類物質(zhì)微膠囊化研究[J].食品科學，2009，30（12）:94-97.PAN Ming，WANG Shi-kuan，GUO Mai-xi，et al.Microencapsulation of flavonoids from chaphalium affine D.Don[J].Food Science，2009，30（12）:94-97.（in Chinese）

[4]王世寬，潘明，任路瑤.大有開發(fā)前景的野生蔬菜——鼠曲草[J].食品研究與開發(fā)，2005，26（4）:95-97.WANG Shi-kuan，PAN Ming，LU Lu-yao.Great prospects for development of wild Vegetable-Gnaphlium affine D.Don[J].Food Research and Development，2005，26（4）:95-97.（in Chinese）

[5]江蘇新醫(yī)學院.中藥大詞典:下冊[M].上海:上海人民出版社，1979:2501-2502.

[6]畢潔，楊慶利，于麗娜，等.花生殼黃酮乙醇提取工藝探討[J].現(xiàn)代化工，2008，28（2）:316-319.BI Jie，YANG Qing-li，YU Li-na，et al.Ethanol extraction technology of flavonoids from peanut hull[J].Modern Chemical Industry，2008，28（2）:316-319.（in Chinese）

[7]Ozkan G，Simsek B，Kuleasan H.Antioxidant activities of Satureja cilicica essential oil in butter and in vitro[J].J Food Eng，2007，79:1391-1396.

[8]Kumaran A，Karunakaran R J.In vitro antioxidant activities of methanol extracts of five Phyllanthus species from India[J].LWTFood Sci Technol，2007，40:344-352.

[9]劉駿.結(jié)晶紫分光光度法測定Fenton反應產(chǎn)生的羥自由基[J].武漢工業(yè)學院學報，2005，24（2）:53-55.LIU Jun.Research on a new method of determination and elimination of free radical[J].Joumal of Wuhan Polytechnic University，2005，24（2）:53-55.（in Chinese）

[10]赫春香，盧麗男，曹璨.熒光動力學分析新方法測定超氧自由基抑制劑的抗氧活性 [J].遼寧師范大學學報:自然科學版，2005，28（1）:73-75.HE Chun-xiang，LU Li-nan，CAO Can，et al.A new method of determination on antioxidant activity of scavening on superoxide radicals by fluorescent kinetic analysis[J].Journal of Liaoning Normal University:Natural Science Edition，2005，28（1）:73-75.（in Chinese）

[11]陸占國，郭紅轉(zhuǎn)，封丹.芫荽莖葉精油成分及清除DPPH自由基能力研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（8）:24-27.LU Zhan-guo，GUO Hong-zhuan，F(xiàn)ENG Dan.Study on chemical constituents of coriander leaf essential oil and scavenging capacity against the DPPH radical[J].Food and Fermentation Industries，2006，32（8）:24-27.（in Chinese）

[12]張爾賢，俞麗君，周意琳.Fe2+誘發(fā)脂蛋白PUFA過氧化體系及對若干天然產(chǎn)物抗氧化作用的評價[J].生物化學與生物物理學報，1996，28（2）:218-222.ZHANG Er-xian，YU Li-jun，ZHOU Yi-lin.Studies on the peroxidation of polyunsaturated fatty acid from lipoprotein induced by iron and the evaluation of the anti-oxidative activity of some natural products[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica，1996，28（2）:218-222.（in Chinese）

[13]喬良博，林華衛(wèi)，馬雄，等.微波輔助提取花生殼中總黃酮的提取工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技，2011，47（4）:34-37.QIAO Liang-bo，LIN Hua-wei，MA Xiong，et al.Study on microwave-assisted extraction technology of the flavonoids from peanut hull[J].Food and Fermentation Technology，2011，47（4）:34-37.（in Chinese）

[14]李云志，曾凡駿，李帆.元寶楓葉總黃酮的提取研究[J].食品與生物技術(shù)學報，2006，25（1）:27-31.LI Yun-zhi，ZENG Fan-jun，LI Fan.The extraction of flavonoids from the leaves of acer truncatum bunge[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2006，25（1）:27-31.（in Chinese）

[15]劉俊，黃少偉，張越非，等.微波輔助提取土茯苓總黃酮[J].中藥材，2007，30（12）:1591-1595.LIU Jun，HUANG Shao-wei，ZHANG Yue-fei.Extracting flavonoids from smilax glabra by microwave-assisted method[J].Journal of Chinese Medicinal Materials，2007，30（12）:1591-1595.（in Chinese）