枯草芽孢桿菌氨肽酶超濾提取技術

曹松龍， 田亞平

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

氨肽酶是一類從蛋白質或肽鏈的N端酶切氨基酸殘基的外肽酶的總稱[1]。氨肽酶種類繁多，不同氨肽酶對N端氨基酸殘基的水解能力不同。即使同一類氨肽酶對不同N端氨基酸殘基的水解能力也有一定的差異。氨肽酶在食品行業、醫學研究等方面具有廣泛的應用。在食品行業，氨肽酶常被應用于各種蛋白質的深度水解以及水解后的脫苦方面，通過氨肽酶的水解可以提高游離氨基酸的含量，改善風味，增加營養價值；在脫苦方面，它可以避免化學試劑的使用所可能帶來的有毒物質。其次，利用氨肽酶制備活性多肽目前也越來越普遍，并且是一種安全高效的方法。另外在醫學研究中，氨肽酶還可以作為醫療診斷用酶。

目前膜分離技術在酶制劑工業的應用越來越廣泛[2-3]。膜分離技術具有物質不發生相態變化、不消耗相變能、耗能耗質少、效率高等特點，可以應用于酶的濃縮和分離過程[4-7]。采用膜分離技術不僅酶活損失小，而且操作簡單，易于實現工業規模的放大[8-10]。作者應用超濾技術對枯草芽孢桿菌氨肽酶進行一定程度的濃縮[11]及脫鹽，所得濃縮脫鹽發酵液為進一步提取創造了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

枯草芽孢桿菌發酵液:本實驗室自制，并經過離心除菌、質量分數18%的（NH4）2SO4澄清的操作。L-亮氨酸-4-硝基苯胺 （AR），美國Alfa公司產品。超濾裝置:FILTECH-UF101型，上海弗立特實業有限公司產品；3種PES卷式超濾膜，截留分子量分別為 10、30、50 kDa；尺寸 35 mm×250 mm；有效過濾面積為0.1 m2。722型分光光度計，上海第三分析儀器廠制造；電熱恒溫水浴鍋，上海醫療器械五廠制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 超濾方法 超濾操作包括濃縮和洗脫脫鹽兩個過程。具體操作:將發酵結束后經預處理的發酵液加到超濾系統中進行濃縮，當濃縮到一定程度時，開始定時加水洗脫，直到發酵液中的鹽基本除去，停止加水，最后再將其濃縮到合適的倍數。

1.2.2 洗膜方法 配制0.01 mol/L的NaOH溶液，在操作壓力0.15 MPa的條件下反復清洗，之后再用去離子水清洗，直到濾液澄清且膜通量恢復到98%左右為止。最后將卷式膜從超濾裝置中取出，貯存于0.01 mol/L的NaOH溶液中。

1.3 測定方法

1.3.1 氨肽酶酶活測定方法 采用LNA法[12]，測定時，首先加入一定量的Tris-HCl緩沖液和底物（L-亮氨酸-4-硝基苯胺 L-leu-pNA），然后再加入一定量稀釋一定倍數的粗酶液，在50℃水浴反應10 min后，405 nm比色測定酶活。酶活力定義:在50℃水浴下，每分鐘分解L-亮氨酸-4-硝基苯胺產生1 μmol的硝基苯胺所需酶量定義為一個酶活單位。

1.3.2 膜通量測定方法 采用量筒接濾出液，同時用秒表計時，最后根據結果計算出單位時間單位膜面積的流出量，即為膜通量。詳見文獻[13]。

1.3.2 蛋白質含量測定方法 采用福林酚法[14]。

1.3.3 殘留（NH4）2SO4測定方法 采用BaCl2來檢驗SO42-的殘留情況，進而判斷（NH4）2SO4的去除情況。

2 結果與討論

依據先前的研究，初步確立了一種提取枯草芽孢桿菌液體氨肽酶的方法。枯草芽孢桿菌的原始發酵液，經離心、澄清、超濾濃縮、脫鹽、醇沉后再溶解獲得液體氨肽酶。提取工藝整個流程圖如圖1所示。

圖1 提取工藝流程Fig.1 Process of the extraction

本文中主要對超濾濃縮、脫鹽過程的各種參數進行優化，提高該過程酶活回收率，以及獲得相對高的膜通量。

2.1 不同截留分子量的PES膜的選擇

由先前文獻報道，知該氨肽酶的分子量約為75 kDa[14]，故選擇 10、30、50 kDa 這 3 種不同截留分子量的PES膜進行研究。將發酵液濃縮到一定倍數后，選擇酶活回收率高且膜通量較大的這種膜，結果見表1。

表1 超濾結果Table 1 Results of ultrafiltration

由表1可知，10 kDa的PES膜過濾后酶活回收率相對較高，達到90%以上，但膜通量太小；50 kDa的PES膜膜通量最高，但酶活回收率太低；只有30 kDa的PES膜既有相對較高的酶活，又有相對高的膜通量。主要原因可能是酶蛋白質分子本身形狀不規則，膜孔徑大小不一，酶蛋白質分子在膜中通過率不同，從而引起酶活回收率改變以及膜通量的差異。綜上分析，選擇30 kDa的PES膜進行超濾操作。

2.2 不同操作壓力對酶活與膜通量的影響

在超濾過程中，維持發酵液的溫度在20℃左右， 通過控制不同的操作壓力 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 MPa來分別測定酶活回收率、膜通量，結果見圖2。

圖2 操作壓力對酶活及膜通量的影響Fig.2 Influence of operating pressure on the activity and membrane flux

由圖2可知，酶活回收率隨操作壓力的增大而減小，而膜通量隨操作壓力的增大而增大。主要原因，一方面是當操作壓力較小時，酶分子在膜中的通過率小，酶活損失較小；隨著操作壓力的增大，酶分子受到較大壓力的作用，在膜中的通過率增大，酶活損失也隨之增多。另一方面，隨著超濾時間的增長，濃差極化現象隨之增加，此時膜通量會顯著下降，因此要盡可能縮短時間來獲得較高的膜通量，就要選擇合適的操作壓力。綜上分析，為了既保證較高的酶活回收率，又獲得相對較大的膜通量，選擇操作壓力在0.2～0.25 MPa范圍內[15]。

2.3 發酵液的初始pH值對超濾濃縮脫鹽的影響

由發酵罐發酵得到的發酵液經離心除菌、低濃度鹽的澄清后，pH值在5.6左右，另外調節發酵液的pH值至6.5、7.5。在操作壓力0.2～0.25 MPa范圍下，將這3種不同pH值的等量發酵液進行超濾濃縮實驗，結果見圖3，圖4。

圖3 不同pH值發酵液的膜通量隨時間的變化曲線Fig.3 Membrane flux changes with time in different pH values of fermentation broth

圖4 不同pH值的發酵液酶活隨時間的變化曲線Fig.4 Enzyme activity changes with time in different pH values of fermentation broth

由圖3，圖4可知，不同初始pH值的發酵液在超濾的過程中，其膜通量以及氨肽酶活變化有一定的差異。當發酵液初始pH值在5.6～6.5范圍時，其膜通量與酶活下降較緩，整個過程中膜通量與總酶活相對較高，可能是因為不同pH值的發酵液其帶電性質與電荷的多少不一樣，若PES膜所帶電荷與酶蛋白質分子所帶電荷相反，則易吸附酶蛋白質分子于膜上，從而影響酶活與膜通量。綜上分析，選擇初始發酵液最佳pH值在5.6～6.5范圍內。

2.4 超濾時間對膜通量以及酶活的影響

隨著超濾操作[16-18]的進行，濃差極化的現象越來越嚴重，于是膜表面形成濃縮的凝膠層，從而引起膜通量下降。本文中對該枯草芽孢桿菌氨肽酶的膜通量以及酶活收率隨時間的變化進行了分析研究，結果見圖5。在超濾過程的前20 min，膜通量下降迅速，主要是因為開始在膜表面沒有其他物質，阻力較小；隨著大分子物質在膜表面沉淀而使阻力迅速增加。在20～60 min階段，膜通量下降相對遲緩一些，主要是膜表面的大分子物質緩慢地加厚，阻力也緩慢地增加，且趨于穩定。在60 min以后膜通量下降加快，同時酶活回收率也急劇下降，說明此時膜污染較嚴重，應立即停止超濾濃縮的操作，需要對膜進行清洗。

圖5 氨肽酶酶活收率及膜通量隨時間的變化曲線Fig.5 Aminopeptidase activity yield and the flux change with the time

2.5 超濾濃縮倍數對酶活以及膜通量的影響

如圖6，隨著超濾的進行，酶活回收率與膜通量都呈顯著的下降趨勢，當濃縮至3倍左右時，酶活回收率在85%左右，此時膜通量也相對較高，之后急劇下降，因此選擇發酵液濃縮至3倍。

2.6 超濾洗脫脫鹽操作過程的控制

經上述超濾濃縮之后，發酵液已濃縮到一定的倍數，此時需要對該濃縮發酵液進行洗脫進一步脫除其中的鹽。向已濃縮過的發酵液中流加水來洗脫除鹽，直到最后將鹽基本脫除干凈。在洗脫的過程中，通過中間取樣來檢測SO42-的殘留情況，進而判斷鹽的殘留情況，直至最后幾乎檢測不到SO42-，說明此時鹽已基本洗脫干凈，停止流加水。綜上分析，最后確定當所用洗脫水的體積為洗脫前濃縮發酵液體積的10倍左右時，發酵液中90%以上的鹽被脫除，該脫鹽過程的酶活回收率為79%。最后以最初發酵液的體積為基準，將該洗脫的發酵液濃縮8～10倍，得到濃縮脫鹽發酵液，整個超濾過程酶活回收率為67.15%。

圖6 氨肽酶酶活收率及膜通量隨濃縮倍數的變化曲線Fig.6 Aminopeptidase activity yield and the flux change with the concentration ratio

2.7 膜的清洗與再生

在超濾操作的過程中，膜的滲透通量會因濃差極化、膜孔堵塞等原因造成膜污染而下降，可以通過定期的清洗使膜恢復其分離功能。針對膜污染的情況，作者采用0.01 mol/L的NaOH溶液對膜進行清洗，使吸附在膜孔和表面的污染物脫落，恢復膜通量。通過研究發現，清洗時間在40～50 min時，膜通量基本可以恢復到98%以上，時間再長膜通量不再有明顯變化。因此清洗時間確定為40～50 min。最后將PES膜液封于0.01 mol/L的NaOH溶液中，并定期更換保存液以避免長菌而造成濾芯的堵塞。

3 結語

采用FILTECH-UF101型超濾系統對枯草芽孢桿菌氨肽酶發酵液進行超濾操作，通過對其超濾過程中操作參數的優化，最終選擇采用截留分子量為30 kDa的 PES膜，操作壓力 0.2～0.25 MPa，發酵液初始pH 5.5～6.5，超濾濃縮倍數為3倍左右時進行洗脫操作，洗脫水的體積為該濃縮發酵液體積的10倍左右，最終將該發酵液濃縮8～10倍。在以上最優條件下，超濾濃縮過程的酶活回收率達85%，洗脫脫鹽過程的酶活回收率達79%，整個過程酶活回收率為67.15%，并且整個過程中膜通量維持在16 L/（m2·h）以上。

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