運用雙向發酵技術建立中藥微生物藥代模型的設想

潘 揚， 彭 薇， 劉春美

（南京中醫藥大學 藥用菌與中藥生物技術研究所，江蘇 南京 210029）

眾所周知，中藥是伴隨著中華民族幾千年的文明史發展傳承下來的寶貴財富。目前，中醫藥在國內雖然有著穩定的市場和生命力，但始終無法得到現代世界醫藥主流的認可。其原因主要是由于傳統中藥缺乏可靠的藥效學、藥物代謝動力學和安全性等一系列基礎研究數據[1]，尤其是中藥的藥物代謝（簡稱中藥藥代）。藥物代謝是指藥物在體內的吸收、分布、代謝和排泄過程。藥物作為外來分子進入人體后，一些藥物以原形從人體排泄；而大多數藥物需要進行氧化、水解、還原、結合等生物化學反應，然后從人體排泄。這些生物化學轉化反應統稱為“藥物代謝”。所謂中藥藥代即中藥成分在體內發生的生物轉化。中藥發揮防治疾病的作用與其在人體內的代謝密切相關[2]。中藥藥代的深入研究對揭示中藥的內在作用機制，優化中藥給藥方案和劑型，促進中藥新藥開發，并最終推動中醫藥走向世界，實現中藥現代化都具有重要意義[3]。

微生物藥代模型是指利用微生物和哺乳動物在對外源性化合物代謝過程中的相似性，用微生物轉化模擬哺乳動物體內藥物代謝反應[4]。哺乳動物的微生物模型從提出至今已被廣泛應用于各種成分明確而單一西藥的代謝研究，成為研究藥物體內代謝的一種重要的輔助工具，但尚未見其在成分復雜的中藥藥代研究中的應用報道。20世紀80年代末，莊毅等在繼承傳統中藥發酵方法的基礎上，創立了“藥用真菌新型雙向固體發酵”方法[5]，簡稱“雙向發酵”技術，它根據固體發酵的特點，直接將優選的菌種加入到中藥材中進行生物轉化。“雙向發酵”對推動中藥微生物藥代模型的研究具有很大的啟發，本文中則通過深入分析中藥“雙向發酵”技術的實用意義及應用前景，對運用其建立中藥微生物代謝模型作一設想。

1 藥物代謝傳統研究及其在中藥應用中的不足

我國的藥物代謝研究始于20世紀50年代，傳統的藥物代謝研究往往是收集用藥后動物的體液（血漿、尿、膽汁和糞便），檢測樣品中藥物及其代謝物；或采用器官灌流[6]、組織切片[7]、細胞培養[8]、組織勻漿及微粒體法[9]等代謝研究方法來完成。隨著分子生物學技術的發展，可利用基因重組表達的細胞色素 P450（Cytochrome P450，CYP450）酶系中某個純酶進行藥物代謝研究[10]。

自1963年起國內開始出現有關中藥藥代的研究[11]，起初主要集中在藥物動力學方面，自20世紀80年代以來，中藥藥物代謝動力學研究已得到迅速的發展，但直到近年，有關中藥藥物代謝的研究才逐漸受到人們的重視[12]。

西藥絕大多數是單體化合物、結構明確，用藥時不存在化學成分之間的相互作用，因而藥物代謝研究比較簡單，其結果也能很好地反映藥物的體內過程。與此相反，傳統的藥物代謝方法用于中藥藥代研究則存在明顯不足:第一，中藥成分類型復雜，種類繁多，且多數成分結構不明。如此繁雜的成分進入人體后，其中肯定存在化合物之間的相互作用，且這種相互作用可能比較復雜，進一步增加了研究的難度。第二，中藥材中多數成分含量很低，化學對照品不易獲得，由于藥物在生物體內的廣泛分布，其代謝轉化的臟器和酶系統的多樣化，藥物及其代謝產物在體內的濃度低，尤其是一些毒副作用較大的中藥如馬錢子、烏頭等，服用劑量十分有限，服用后腸道代謝物的濃度本身很低，進入血漿中的濃度就更低，因此直接從血漿、膽汁等生物體液中提取分離有一定困難[13]，更談不上弄清它們的化學結構。第三，傳統藥物代謝的技術要求較高，成本昂貴，操作復雜，要消耗大量的實驗動物，違背了目前醫藥學動物實驗中提倡的“3R”原則。

2 微生物藥代模型理論基礎及其優勢

倡導使用微生物模型探索哺乳動物的藥物代謝已有相當長的歷史。1974年，Smith和Rosazza在研究芳香化合物的微生物羥基化時，發現微生物特別是真菌的代謝物和哺乳動物具有相似性，并因此首次提出了 “哺乳動物藥物代謝的微生物模型”的概念[14]。利用微生物轉化系統來模擬哺乳動物藥物代謝情況，使得微生物轉化方法及其研究思路應用到藥理學和毒理學研究領域，推動了藥物代謝的研究。微生物代謝模型的核心理論是:真菌和哺乳動物都是真核細胞生物，兩者主要的生理功能中含有類似的酶作用機制，對外源性化合物的代謝有相似的系統和過程。因此，真菌（微生物）轉化模擬哺乳動物藥物代謝途徑就有一定的預見性[15]。

隨著對微生物轉化研究的深入，大量科學事實證實，在很多情況下，微生物轉化與哺乳類動物代謝途徑相平行，真菌等多種微生物特別是絲狀真菌具有與哺乳動物藥物代謝功能非常相似的藥物代謝酶，如細胞色素P450同工酶和葡萄糖苷酶等[16]，可進行某些與哺乳動物相同的Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應。細胞色素P450酶系（CYP450）在人體內主要存在于肝臟中，是肝微粒體混合功能酶系的末端氧化酶，由NADPH、NADPH-P450還原酶脂質和多種P450同工酶組成。P450酶是體內藥物發生代謝轉化的關鍵酶，藥物半衰期、肝臟首過效應、藥物相互作用等藥動學特征均與藥物代謝的CYP450有關[17]。微生物轉化的實質就是微生物利用自身的酶系對外源性化合物（底物）進行轉化，從而產生相應的產物。所有的有機化學反應類型幾乎都可以通過微生物轉化實現。真菌等多種微生物具有與哺乳動物藥物代謝酶功能非常相似的細胞色素P450酶系和葡萄糖苷酸酶等，真菌的細胞色素P450酶與哺乳動物類似也是結合在內質網膜上，因而可進行與哺乳動物相同的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝反應。如含有細胞色素P450酶系的小克銀漢霉屬真菌，已廣泛應用于多種藥物的微生物代謝模型研究[18]。Wang Rong-fu等[19]利用真菌微粒體的單克隆抗體篩選雅致小克銀漢酶（C.elegans ATCC 3612）的cDNA文庫，得到一個含有全部C.elegans P450基因的cDNA，并利用質粒E.coll系統（pQE30）實現了過量表達。免疫印跡實驗顯示，哺乳動物P450酶系的3個抗體（CYP1A1、CYP2E1和 CYP3A1）與 E表達呈陽性反應，證實了雅致小克銀漢霉含有與哺乳動物相似的細胞色素P450酶。微生物（真菌）中含有與哺乳動物類似的P450酶系，為建立藥物 （包括中藥）微生物代謝模型提供了理論依據。

真菌（微生物）轉化可模擬哺乳動物的藥物代謝已得到公認，與其它代謝方法相比具有以下優點[20]:

1）從技術上:①微生物來源廣泛、種類繁多，可提供大量的模型供篩選；②建立微生物轉化體系的操作簡單、易于控制，可規模化制備；③通過調節優化條件，可顯著提高代謝產物的收率，再經分離純化獲得代謝產物單體進行結構鑒定、藥理和毒理研究；④與細胞或組織模型相比，可以使用較高的底物濃度，代謝物的產率高，易于檢測以及樣品的分離純化。

2）從效益上:建立微生物轉化體系的成本較低，綠色環保，可規模化制備。

3）從社會倫理上:可減少實驗動物的使用，符合目前醫藥學動物實驗中提倡的“3R”原則。

通過篩選得到能產生與動物（或人）體內相同代謝物的微生物菌株，經過轉化條件的優化，可方便快捷地獲得目標代謝物并進行結構鑒定，且較容易地與動物（或人）體內的代謝物進行比對，以復制藥物在生物體內的代謝過程。哺乳動物代謝的微生物模型理論已被廣泛地應用，成為研究體內代謝的一種重要的輔助工具[21-22]。目前已見到應用微生物模型研究中藥單體成分藥物代謝的少量報道，而直接對成分復雜的藥材進行此方面研究則尚未見報道。由此可見，建立適合于中藥藥代規律的微生物藥代模型急需理論上的突破與實踐上的創新。

3 微生物藥代模型的應用現狀

目前，隨著國外有關微生物代謝模型的各種研究數據的日積月累[20，23]，關于微生物轉化的思路得到了普遍認同。國內對這一領域的研究主要是針對成分單一的化學藥，如普羅帕酮[24]、苯丙呱林[25]、SFZ-47[26]、維拉帕米[27]、間尼索地平[28]、昂丹司瓊[29]、安非他酮[30]和哈爾明堿[31]等，研究方法和手段也是日漸成熟，為將微生物代謝模型應用于中醫藥提供了充足的技術支持。

在中藥研究方面，雖然活性單體化合物如馬兜酸A和B[32-33]、芍藥苷和芍藥內酯苷[34]的研究已采用了微生物代謝模型，但迄今為止還未將微生物代謝模型直接應用于中藥材或中藥復方的代謝研究，只是將微生物應用于中藥活性成分及中藥復方轉化的研究取得了一定的進展[35]。據報道，應用微生物轉化的中藥化學成分包括生物堿、苷類、萜類、黃酮類、甾類、醌類等[36]等幾乎所有中藥成分的結構類型。這些微生物轉化研究為建立中藥微生物代謝模型奠定了一定的技術基礎，也充分證明了建立中藥微生物代謝模型的可行性。

4 應用雙向發酵技術建立中藥微生物代謝模型的設想

傳統的中藥固體發酵已經有著較為悠久的歷史，主要是通過微生物和酶的催化分解作用對天然藥物進行生物轉化。由于微生物有強大的分解轉化物質的能力，故通過發酵可使藥材產生特殊的化學成分變化[37]。20世紀80年代末，莊毅等在繼承傳統發酵方法的基礎上，創立了“藥用真菌新型雙向固體發酵”方法[5]簡稱“雙向發酵”，它根據固體發酵的特點，可直接將優選的菌種加入藥材中進行微生物轉化。

雙向固體發酵技術的理論基礎是優選合適的藥用真菌對具有活性成分的中藥材 （即藥性基質）進行固態發酵，藥性基質不僅能提供真菌所需的營養，同時又因真菌酶的作用，分解（合成）轉化藥性基質的組織成分使原有的成分轉化，形成新的藥用菌質。發酵過程具有“雙向性”，因此也被稱為“雙向發酵”[38]。雙向發酵的特點是采用了中藥材作為基質，所產生的發酵產物（藥性菌質）既含有中藥殘渣及其活性成分，又含有菌體及其代謝物的全組分。目前，該技術已廣泛應用于多種中藥材的生物轉化，達到降毒存效、改變藥性及增加適應癥等目的。

一般來說，中藥通過真菌雙向發酵產生的發酵品，其化學成分與原藥材成分相比都發生了明顯變化。 研究顯示，中藥巴豆[39-40]、川烏[41]、馬錢子[42]、雷公藤[43-44]、三七[45]等采用不同菌種進行雙向固體發酵后，所得的藥性菌質與藥材生品相比，其活性成分（有毒或有效成分）的含量均有不同程度的變化，并且有新成分產生。由于這個過程與中藥在體內的代謝過程極為相似，因此可以通過篩選合適的菌種對中藥材進行雙向發酵來模擬哺乳動物的藥物代謝。同時，固體發酵彌補了液體發酵不能直接用于中藥材的缺陷，為模擬中藥復雜體系藥物代謝提供了可能性；且它幾乎是對中藥全成分進行轉化，更能體現中藥成分作用于機體的整體觀。

初步設想分3個步驟建立中藥微生物代謝模型。

4.1 中藥有效單體和部位成分微生物代謝模型的研究（液體發酵）

見圖1。

圖1 液體發酵技術路線Fig.1 Technical route for liquid fermentation

4.2 中藥材微生物代謝模型研究（雙向固體發酵）

見圖2。

圖2 雙向固體發酵技術路線Fig.2 Technical route for bi-directional sotid fermentation

4.3 液體發酵與雙向固體發酵模型的比較研究

見圖3。

圖3 比較研究框圖Fig.3 Comparison between liquid fermentation models and bi-directional sotid fermentation models

5 結語

藥物代謝不僅影響藥物作用的發揮，也與藥物毒性的產生息息相關。中藥代謝研究要以中醫基礎理論為指導，對中醫講究的整體觀進行闡述，才能更好地發現其代謝規律，探明中藥作用的物質基礎。目前，已有的體外代謝模型直接用于中藥代謝研究的尚不多見。本文中首次提出利用雙向發酵技術應建立中藥微生物代謝模型的設想，即采用體外微生物模型模擬中藥體內代謝，預測其在人體中的代謝過程，更有利于探索中藥整體成分的代謝規律，進而闡明中藥效應的物質基礎。這對于代謝率低、毒性大及缺少靈敏檢測手段的中藥代謝研究，無疑是開拓了一條廣闊的新路，且這種以整體成分作為研究對象的研究方法，也可以為一直以來難以突破的中藥復方代謝研究提供有效的手段。因此，基于雙向發酵技術建立中藥微生物代謝模型，采用微生物模型作為研究中藥體內代謝的方法，有望給中藥及其復方的代謝研究工作帶來新的生機；同時，采用微生物模型作為研究中藥體內代謝的一個重要工具，需要將微生物轉化與藥理學、生物化學和現代分析方法等多重學科、多領域有機結合，這給中藥藥物代謝研究工作帶來的既是一種機遇，更是一種挑戰。

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