E B V-DNA定量檢測(cè)對(duì)鼻咽癌的診斷

李 哲 翁玉玲.廣東省東莞市大朗醫(yī)院輸血科，廣東東莞 53770；.廣東省東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 53000

E B V-DNA定量檢測(cè)對(duì)鼻咽癌的診斷

李 哲1翁玉玲2
1.廣東省東莞市大朗醫(yī)院輸血科，廣東東莞 523770；2.廣東省東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523000

目的通過(guò)對(duì)鼻咽癌患者經(jīng)治療后EBV-DNA含量變化的觀察，為臨床診治該病尋求最佳方法。 方法 血漿EBV-DNA檢測(cè)采用熒光定量PCR法，選擇確診的145例鼻咽癌患者為研究對(duì)象，對(duì)其EBV-DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，并以同期健康者140名的血漿情況進(jìn)行對(duì)比研究。 結(jié)果 鼻咽癌組中有136例（93.79%）患者血漿EBVDNA呈陽(yáng)性；健康組中有10例（7.14%）血漿EBV-DNA呈陽(yáng)性，鼻咽癌組患者血漿EBV-DNA陽(yáng)性檢出率明顯高出健康組（P<0.01）；血漿EBV-DNA呈陽(yáng)性的患者在治療過(guò)程中，血漿EBV-DNA含量呈逐漸下降趨勢(shì)。結(jié)論 給予鼻咽癌患者EBV-DNA定量檢測(cè)，對(duì)診斷和指導(dǎo)治療價(jià)值明顯。

EBV-DN；定量檢測(cè)；鼻咽癌；診斷

EB病毒（EBV）是一種普遍存在的皰疹病毒群，感染后能累及機(jī)體全身各個(gè)器官系統(tǒng)[1]。人體一旦被該病毒侵入，易引起癌變。鼻咽癌在我國(guó)的發(fā)病率較高，多發(fā)于我國(guó)南方[2]。該病屬于惡性腫瘤的一種，目前雖未清楚其致病源，但自患者血漿中發(fā)現(xiàn)了EBV-DNA后，普遍存在觀點(diǎn)認(rèn)為該病的發(fā)病與EBV感染有關(guān)聯(lián)。多位學(xué)者研究證實(shí)：對(duì)患者血漿中EBV-DNA含量的檢測(cè)，可觀察到機(jī)體內(nèi)腫瘤負(fù)荷狀況。本院將已被確診的145例鼻咽癌患者為研究對(duì)象，并以同期身體健康者140名進(jìn)行對(duì)比研究，旨在探討EBV-DNA定量檢測(cè)對(duì)鼻咽癌患者的臨床作用，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2012年1月～2012年6月已被本院確診的145例鼻咽癌患者（鼻咽癌組）為研究對(duì)象，其中，男85例，女60例，年齡2～76歲，平均45歲；其中泡狀核癌、低分化鱗癌、中分化鱗癌例數(shù)分別為21、86、38例。同時(shí)選擇身體健康者140名為健康組，進(jìn)行對(duì)照研究。

1.2 方法

1.2.1 血漿EBV-DNA檢測(cè)采用熒光定量PCR法[3]。標(biāo)本采集手段：抽取研究對(duì)象外周血3mL，置入EDTA抗凝管內(nèi)，給予每分鐘4000r離心后實(shí)施上層血漿分離，將被分離出的50μL血漿存放在零下20℃的溫度中；試劑盒選擇德國(guó)Qiagen公司提供，對(duì)分離出的血漿按說(shuō)明要求進(jìn)行血漿DNA提取。熒光定量PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增的目的基因?yàn)镋BV的BamH1-W片段。上下游引物序列分別是W-44F和W-119R，給予每批PCR以雙蒸水為陰性參照；克隆合成的EBV的DNAW片段為陽(yáng)性參照，將其稀釋為不同的濃度梯度后給予擴(kuò)增，濃度梯度為：106、105、104、103、102、10copies/uL；PCR以50μL為反應(yīng)總體積，其中含緩沖液10μL PCR，引物與相對(duì)的熒光標(biāo)記探針各為10pmol。dATP、dCTP、dGTP、dUTP 均為 200μmol/L 5U Tap 聚合酶，5μL DNA模板，將提取的DNA置入PCR反應(yīng)管中實(shí)施擴(kuò)增。計(jì)算血漿EBV-DNA拷貝數(shù)，當(dāng)結(jié)果低于1×103拷貝/mL視為陰性。

1.2.2 治療方法 給予患者放療結(jié)合化療法。放療：Siemens直線加速器6MV X線體外照射，照射范圍包括鼻咽部腫瘤及頸部淋巴引流區(qū)，進(jìn)行常規(guī)分割放療，每天2Gy，1周5次，鼻咽部給予6mV X線照射，頸部 12MeV β線與9MeV β線照射。化療：在進(jìn)行放療當(dāng)天、第4周最后1d、第7周最后1d，均給予順鉑聯(lián)合亞葉酸鈣200mg/m2聯(lián)合5-氟尿嘧啶500mg/m2化療，共計(jì)4個(gè)療程，3周為1個(gè)療程；化療同時(shí)應(yīng)充分水化并聯(lián)合止吐處理，并注意復(fù)查患者血常規(guī)、肝腎功能和心電圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人員血漿EBV-DNA陽(yáng)性檢出率

鼻咽癌組中有136例 （93.79%）患者血漿EBV-DNA呈陽(yáng)性；健康組中有10例（7.14%）血漿EBV-DNA呈陽(yáng)性，鼻咽癌組患者血漿EBV-DNA陽(yáng)性檢出率明顯高出健康組（P<0.01），見(jiàn)表 1。

表1 兩組血漿EBV-DNA陽(yáng)性檢出率對(duì)比表（n）

2.2 鼻咽癌組治療后不同時(shí)期血漿EBV-DNA水平

對(duì)136例血漿EBV-DNA陽(yáng)性患者治療后：有125例患者經(jīng)治療后EBV-DNA含量逐漸下降，在42d后未能檢測(cè)出含有EBV-DNA，其余11例仍含有EBV-DNA，情況見(jiàn)表2。

表2 136例血漿EBV-DNA陽(yáng)性患者不同時(shí)期血漿EBV-DNA水平（IU/mL）

3 討論

EBV特點(diǎn)為親淋巴細(xì)胞性和親上皮細(xì)胞性[4]。經(jīng)臨床資料顯示EB病毒感染淋巴細(xì)胞是致鼻咽癌的主要因素，對(duì)該病的診斷，目前以影像學(xué)檢查為主，但該檢查存在費(fèi)用高、對(duì)治療效果的判定差、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移敏感性不高等缺點(diǎn)，因此，在臨床的采用上受到一定限制。該技術(shù)手段因?qū)儆诰植匡@影技術(shù)，導(dǎo)致其不能對(duì)可能會(huì)發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移部位進(jìn)行完全檢測(cè)，同時(shí)對(duì)較小的轉(zhuǎn)移處、殘存腫瘤性質(zhì)的判斷等方面均被制約。伴隨核酸分子雜交與PCR技術(shù)的進(jìn)步，鼻咽癌診斷方式也隨之更新，PCR技術(shù)因具有高特異、高靈敏和有效防污的優(yōu)點(diǎn)在臨床備受親睞，當(dāng)檢測(cè)到患者體內(nèi)EBV-DNA拷貝數(shù)高，說(shuō)明其病癥較重。本文對(duì)兩組人員血漿EBV-DNA陽(yáng)性檢出率對(duì)比中發(fā)現(xiàn)：鼻咽癌組中有136例（93.79%）患者血漿EBV-DNA呈陽(yáng)性；健康者組中有10例（7.14%）血漿EBV-DNA呈陽(yáng)性，鼻咽癌組患者血漿EBV-DNA呈陽(yáng)性檢出率明顯高出健康組 （P< 0.01）；鼻咽癌組患者在治療過(guò)程中，血漿EBV-DNA含量呈逐漸下降趨勢(shì)，由此可見(jiàn)：鼻咽癌的發(fā)生和EBV之間存在密切聯(lián)系。

鼻咽癌是鼻咽上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，在我國(guó)南方頭頸部惡性腫瘤中發(fā)病率居前位[5]。該病的發(fā)病與EBV有關(guān)，EBV病毒歸類為皰疹病毒科，EBV病毒一旦被感染，將在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄 EBER，在其感染后生成的相關(guān)產(chǎn)物可引發(fā)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的抑制及一系列基因變異而導(dǎo)致惡變。EB-DNA拷貝數(shù)，VCA-IgA抗體滴數(shù)以及EA-IgA抗體滴數(shù)可間接反映EB病毒在人體內(nèi)的激活狀態(tài)[6]。在本次研究中可以顯示出：其檢測(cè)值能間接體現(xiàn)出咽后淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀況。鼻咽癌的惡性程度高，有些患者在鼻咽鏡檢查尚未發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶時(shí)，就有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[7]。在患者外周血中有多種EB病毒相關(guān)的抗原、抗體，早期以采用血漿VCAIgA當(dāng)作對(duì)鼻咽癌治療效果評(píng)判的血液學(xué)指標(biāo)，但其不能及時(shí)反應(yīng)腫瘤消長(zhǎng)變化情況。檢測(cè)血清中抗EB病毒抗體水平是臨床上輔助診斷鼻咽癌的常規(guī)手段[8]，該手段取材方便且易于操作，具備敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用與鼻咽癌的篩查及鼻咽癌放療后復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。

總之，給予鼻咽癌患者EBV-DNA定量檢測(cè)，對(duì)診斷和指導(dǎo)治療價(jià)值明顯，值得臨床應(yīng)用。

[1]柳文菊，杜昆.監(jiān)測(cè)血漿EBV-DNA含量在鼻咽癌診療中的意義[J].海南醫(yī)學(xué)，2012，23（18）：7-9.

[2]王雪英.定量檢測(cè)血漿EBV-DNA在鼻咽癌診治中的臨床研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（12）：5-6.

[3]李杰.血漿EBV-DNA檢測(cè)對(duì)鼻咽癌的診斷價(jià)值的探討[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2011，22（1）：20-22.

[4]孔平.鼻咽癌患者血漿與PBMC EBV-DNA定量測(cè)定的臨床意義[J].山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2010，32（5）：321-324.

[5]應(yīng)香嵐，楊幼萍，應(yīng)亞君，等.EBV病毒PCNAKi-67和C-myc癌基因蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)及預(yù)后意義[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2011，13（11）：1201-1203.

[6]趙淑芬，朱超綱，陳新林，等.鼻咽癌咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與EBV-DNA血清學(xué)標(biāo)記物關(guān)系探討 [J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（10）：2034-2036.

[7]范國(guó)宇，劉偉.血漿EBV-DNA與VCA-IgA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)鼻咽癌診斷的意義[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2012，7（19）：46-47.

[8]魏世鴻，羅宏濤，王小虎，等.血清EBV抗體檢測(cè)聯(lián)合99mTc-MIBI顯像和MRI在診斷鼻咽癌放射治療后復(fù)發(fā)中的價(jià)值[J].甘肅醫(yī)藥，2012，31（5）：327-330.

Quantitative detection of EBV-DNA for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma

LI Zhe1WONG Yuling21.Department of Blood Transfusion,Dalang Hospital of Dongguan City in Guangdong Province,Dongguan 523700, China;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Dongguan City in Guangdong Province,Dongguan 523000,China

ObjectiveTo seek the best approach of diagnosis and treatment for the disease through observing the changes of EBV-DNA content of nasopharyngeal carcinoma patients after treatment.MethodsThe plasma EBV-DNA was detected by fluorescence quantitative PCR method.One hundred and forty five patients confirmed as nasopharyngeal carcinoma were selected as study object.Their plasma EBV-DNA were detected and compared with those of 140healthy persons in corresponding time.ResultsIn the nasopharyngeal carcinoma group,136cases(93.79%)showed plasma EBV-DNA-positive,while 10cases(7.14%)in healthy group.The plasma EBV-DNA-positive detection rate of nasopharyngeal carcinoma group was significantly higher than that of healthy group(P＜0.01).In plasma EBV-DNA-positive patients,the plasma EBV-DNA content decreased gradually in the course of treatment.ConclusionThe quantitative detection of EBV-DNA for nasopharyngeal carcinoma patients has significant value in diagnosing and guiding treatment of the disease.

EBV-DN;Quantitative detection;Nasopharyngeal carcinoma;Diagnosis

R739.6

A

1674-4721（2013）05（b）-0106-02

2013-03-01 本文編輯：魏玉坡）