牛支原體耐藥性研究進展

孔令聰，張春艷，高云航，馬紅霞，3*

(1.吉林農業大學動物科技學院，長春130118;2.文登市張家產畜牧獸醫工作站，山東文登 264407;3.動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春130118)

牛支原體(Mycoplasma bovis，M.bovis)是能引起牛支原體肺炎和乳房炎的病原，于1961年首次從患有乳房炎的病牛中分離［1］，1976年被報道與牛呼吸系統疾病有關［2－3］。近年來，該病原在世界范圍內呈快速傳播態勢［4－6］。辛九慶等［7］首次在我國從犢牛肺臟中分離得到牛支原體。繼而，國內部分地區新從外地引進的肉牛均爆發了牛支原體肺炎，給我國畜牧養殖業造成了巨大的經濟損失，引起了國家有關部門的高度重視［8－10］。

由于M.bovis不具有細胞壁，因此β－內酰胺類對其治療無效。此外，由于近年來抗生素的廣泛使用，其持續的選擇耐藥性壓力使M.bovis逐漸出現了耐藥株，且耐藥率高，范圍廣，呈多重耐藥，其產生耐藥性的直接后果不僅給控制和治療該病帶來困難，而且加劇了抗生素在牛體內的殘留，因而，牛支原體的耐藥尤其是多重耐藥問題已經引起了人們的廣泛關注［11］。

1 M.bovis的耐藥性研究

目前，僅有美國具有商業化的疫苗用于預防牛支原體的感染，而其它國家均采用抗菌藥物進行治療［12］。牛支原體耐藥而導致的臨床抗感染失敗已屢見不鮮，為此，越來越多的臨床工作者積極開展了牛支原體耐藥性檢測的相關研究。

1.1 國外部分地區對M.bovis的耐藥性研究 Ayling R D等［12］報道對在英國分離的62株 M.bovis進行了耐藥性檢測，其結果表明，20%的菌株對土霉素、壯觀霉素、氟苯尼考耐藥，98%的菌株對替米考星耐藥，僅部分菌株對達氟沙星敏感［12］。Laak E T等［13］對臨床分離株進行了體外抑菌試驗，結果顯示，所有受試菌株對泰樂菌素、吉他霉素、硫姆林敏感;對硝呋喹酸、土霉素、鏈霉素、金霉素中度敏感，對多西霉素、米諾霉素耐藥。Ricardo F R等［14］對臨床分離的233株牛支原體進行了抑菌試驗并測定其最低抑菌濃度(MIC)值，結果顯示，60%菌株對大觀霉素和氯四環素耐藥，對替米考星已高度耐藥，其MIC＞128 μg/mL 的菌株占 60%。Uemura R等［15］報道，從日本本地牛和澳大利亞進口的牛中分離得到88株M.bovis，并采用13種抗微生物藥物對其進行了耐藥性分析，結果表明，從日本本地牛分離的菌株對大環內酯類、四環素類、甲砜霉素、氟甲喹、卡那霉素、林可霉素、氟霉素高度耐藥，對大觀霉素、氟喹諾酮類敏感，從澳大利亞牛分離的菌株對紅霉素、甲砜霉素高度耐藥。Marty S等［16］對在美國分離的192株牛支原體進行了耐藥性檢測，并用細胞流式計數器對其結果進行分析，結果顯示，所分離菌株對大觀霉素、頭孢噻呋高度耐藥，對氟苯尼考、恩諾沙星、四環素等藥物相對敏感，其在牛乳中分離的菌株比在肺臟中分離的菌株耐藥程度稍高。

1.2 國內部分地區對M.bovis的耐藥性研究 閆鳳英等［17］對臨床分離的M.bovis進行了耐藥性檢測，結果表明，大部分菌株對放線菌素D、絲裂霉素中度敏感，對紅霉素、鏈霉素、多粘霉素高度耐藥。筆者所在研究室自2010年以來從我國部分地區分得4株M.bovis，并對其進行耐藥性檢測，結果顯示，所有菌株均對氟苯尼考和環丙沙星呈現相對耐藥，其MIC為16μg/mL和8μg/mL，對替米考星相對敏感，其MIC ≦2μg/mL。

綜上所述，不同國家和地區分離的M.bovis，對常用的各種抗生素均顯示出不同程度的耐藥性，且獸醫臨床使用頻率較高的抗生素，其產生的耐藥性較高。此外，M.bovis的耐藥性存在著一定的地域差異性，這可能與不同國家和地區在動物治療中所使用或在飼料中添加的抗生素的種類以及使用方法、對藥物的用量標準不同有關，從而造成了不同國家和地區M.bovis的耐藥性有所差異。

2 支原體的相關耐藥機制研究現狀

目前，牛支原體耐藥機制的研究還很少見，為此，本文對牛支原體和與他同源關系較近的肺炎支原體和人型支原體耐藥機制的研究現狀做以綜述，以期為牛支原體耐藥機制的研究提供參考。

2.1 M.bovis耐藥機制研究現狀 相關研究證明M.bovis對喹諾酮類抗生素的耐藥機制與其他微生物類似，其發生 gyrA、gyrB、parE、parC基因的突變，是介導其產生對喹諾酮類藥物產生抗性的主要機制。Shabat M等［17］在對42株牛支原體進行耐藥性檢測的同時，也對其喹諾酮耐藥決定區的堿基進行了測序分析，其結果顯示，parC耐藥決定區第265位發生了G→A的堿基突變(符合大腸埃希氏菌QRDR區突變規律)，并通過SNP－RT－PCR建立了快速檢測基因突變的方法，既簡單又快速的檢測出耐藥株，進而降低臨床用藥成本。

2.2 肺炎支原體的耐藥機制研究現狀 Atsuoka M等［18］在日本的三個地區分離到76株肺炎支原體，并篩選到13株對大環內酯類抗生素高度耐藥的菌株(MIC均大于256 μg/mL)，其中，10株菌在核糖體23SrRNA的2063位發生由A→G的點突變，1株在2063為發生A→C的點突變，1株在2064位發生A→G的點突變。Pereyre S等［19］通過在亞抑菌濃度中連續傳代的方法將肺炎支原體敏感株誘導成為耐藥株，并對其23SrRNA結構域Ⅴ和Ⅱ進行測序分析，結果顯示，耐藥株23SrRNA結構域Ⅴ中心環發生了2611位由C→A的點突變和2062位A→G的點突變，同時核糖體蛋白L4、L22亦發生了改變，所有耐藥株的23SrRNA結構域Ⅱ均未發生堿基突變。在我國，辛德莉等［20］從臨床分離得到4株對紅霉素耐藥的肺炎支原體，并首次對支原體的耐藥機制進行了研究，對其23SrRNA基因序列比對后發現，兩株在結構域Ⅴ發生了2063位A→G的點突變，另外兩株發生了2064位A→G的的點突變。Yun Y等［21］對臨床分離耐大環內脂類抗生素的18株肺炎支原體的耐藥機制進行研究，結果顯示，其耐藥株的23SrRNA不但發生了2063位A→G和2064位A→G的點突變，還發生了2617位C→G和2067位A→G的點突變，并進一步證明其2063位靶位突變介導了14元大環內酯類藥物耐藥，2064位靶位突變介導了14和16元大環內脂類耐藥，2617位靶位突變介導了14和15元大環內脂類耐藥，此外，2067位靶位突變與支原體對交沙霉素耐藥有關。

此外，隨著對大環內酯類抗生素耐藥機制研究的深入，外排泵的作用得到了高度的重視，mefA、mefE、mreA等基因編碼的外排泵蛋白能提供對14元、15元大環內酯類的抗性，進而導致細胞內抗生素的濃度降低，但支原體是否也存在其類似的機制，目前還未見相關報道［22］。

2.3 人型支原體的耐藥機制研究現狀 Robertson等［23］在對人型支原體進行耐藥性檢測的同時，運用斑點雜交技術對其耐藥基因進行了檢測，結果表明，人型支原體存在四環素抗性決定子(Tetracycline resistance determinant，tetM)，支原體對四環素類抗生素產生抗性，主要是通過tetM基因轉移而產生的，tetM廣泛存在于細菌中，其基因序列位于質粒上，可編碼639個氨基酸的蛋白質，該蛋白不但能與核糖體結合，阻止四環素附著于30S亞基，還能保護核糖體，不受四環素類抗生素的抑制，從而使其對四環素類抗生素產生抗性。但M.bovis對四環素的耐藥性是否也與tetM基因有關，還未見相關報道。

此外，與支原體親緣關系較近的金黃色葡萄球菌對喹諾酮的耐藥機制已有闡明，其主要是藥物的主動外排系統(efflux system)，其為norA編碼的多肽，含388個氨基酸，norA引起的喹諾酮類耐藥程度與藥物的親水性強弱有關［24－25］。

3 問題與展望

目前，作用于核蛋白體的大環內酯類、喹諾酮類和四環素類抗生素仍是獸醫臨床治療M.bovis的首選藥，但隨著藥物選擇壓力的持續促使M.bovis耐藥株逐漸產生，不但使其導致的肺炎、乳房炎的治療成本不斷增加，而且加劇了抗生素在牛體內的殘留。經國內外學者研究證實，肺炎支原體和人型支原體的耐藥機制主要與藥物靶位的突變和質粒攜帶耐藥基因的表達等因素有關［26］，是否同樣的機制也發生在M.bovis上，尚未見相關報道。為此，研究 M.bovis的耐藥性和耐藥機制，尋求有效的治療方案病并設法尋求解決M.bovis耐藥的方法，將為促進養牛業健康持續發展和保障食品安全奠定基礎。

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