大鼠顳葉癲癇點(diǎn)燃后海馬zif268mRNA及其蛋白的時(shí)空表達(dá)變化

李春女， 李 淞， 李秀杰， 張淑琴， 梁建民

致癲過(guò)程包括分子、細(xì)胞和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的級(jí)聯(lián)變化［1］:神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)早期急性損害在最初數(shù)分鐘至數(shù)天出現(xiàn)，包括神經(jīng)細(xì)胞膜除極引起的離子通道動(dòng)力學(xué)快速變化、功能蛋白的翻譯后修飾和即早基因(immediate early gene，IEGs)活化;在數(shù)小時(shí)至數(shù)周出現(xiàn)的亞急性反應(yīng)包括轉(zhuǎn)錄事件、神經(jīng)元死亡和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng);在數(shù)周至數(shù)月出現(xiàn)的慢性反應(yīng)主要包括解剖學(xué)改變:如神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建和膠質(zhì)增生。IEGs編碼蛋白作為神經(jīng)細(xì)胞表面受體、胞質(zhì)第二信使系統(tǒng)和核內(nèi)特異靶基因間胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第三信使，可作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)或下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)基因表達(dá)。因此，IEGs被喻為神經(jīng)元短期興奮性轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)期癲癇表型的分子開(kāi)關(guān)［2］，此外，IEGs也是癲癇后神經(jīng)元凋亡的重要調(diào)控因子之一［3］。zif268(也稱(chēng)為 Egr-1、NGFI-A 或Krox 24)由Milbrandt于1987年首先克隆發(fā)現(xiàn)的一種IEGs［4］。zif268與長(zhǎng)期記憶、空間記憶能力的鞏固密切相關(guān)［5］，可能是調(diào)節(jié)記憶相關(guān)蛋白合成的關(guān)鍵因子，也可能參與癲癇病理過(guò)程［6，7］。我們過(guò)去發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇大鼠存在空間記憶損害［8］，本研究探討海馬zif268時(shí)空表達(dá)與顳葉癲癇腦損傷的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性Wistar大鼠83只，體重約250g，月齡約2.5月，購(gòu)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。試劑:KA和DEPC(美國(guó)Sigma公司)、多聚甲醛(北京化學(xué)試劑公司)、zif268mRNA原位雜交試劑盒和Zif268免疫組織化學(xué)試劑盒(美國(guó) Santa cruz公司)。儀器:立體定位儀(美國(guó))、HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)(日本)。

1.2 動(dòng)物分組 Wistar大鼠83只，麻醉死亡2只，點(diǎn)燃后抽搐死亡3只，最終參與實(shí)驗(yàn)78只，包括正常組6只，Sham組和TLE組各36只。后兩組按點(diǎn)燃或假手術(shù)后 6h、24h、72h、7d、14d、21d 時(shí)間點(diǎn)分為6小組，每小組6只。

1.3 顳葉癲癇模型建立 按以往方法［8］，在立體定位儀下，采用KA杏仁核微量注射方法建立大鼠顳葉癲癇點(diǎn)燃模型。按Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將大鼠癲癇發(fā)作分為0～Ⅴ級(jí)［9］，大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)或以上發(fā)作者為點(diǎn)燃成功。假手術(shù)組杏仁核注射與KA等體積的PBS緩沖液。

1.4 石蠟切片標(biāo)本制備 分別于點(diǎn)燃或假手術(shù)后6h、24h、72h 和 7d、14d、21d 再次麻醉大鼠，經(jīng)4%多聚甲醛液心臟灌注固定后取腦，以視交叉后4mm和8mm處行冠狀切片，片厚4mm，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成5μm厚連續(xù)冠狀切片。

1.5 原位雜交檢測(cè) 原位雜交過(guò)程按zif268mRNA原位雜交試劑盒說(shuō)明書(shū)操作:主要步驟為切片脫蠟、二甲苯和梯度乙醇處理后用0.01%曲拉通X-100溶液浸泡，用3%H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，復(fù)合消化液暴露mRNA片段，預(yù)雜交，雜交，切片，IgG封閉和阻斷，滴加生物素化抗地高辛抗體;滴加高敏TSP(ZYMED)SABC過(guò)氧化物酶復(fù)合物，DAB劑顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后光鏡觀(guān)察，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞被染成棕黃色。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè) Zif268蛋白表達(dá)采用免疫組織化學(xué)ABC法，用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉親和素蛋白連接的過(guò)氧化酶及基質(zhì)混合液的反應(yīng)來(lái)測(cè)定細(xì)胞中的抗原，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行:包括切片脫蠟、二甲苯和梯度乙醇處理后用0.01%曲拉通X-100溶液浸泡，用3%H2O2處理，正常山羊血清封閉后，滴加特異性第一抗體，37℃濕盒孵育2h，內(nèi)源性生物素封閉和阻斷，滴加特異性生物素化第二抗體，37℃濕盒孵育50min，DAB顯色5min，蘇木素復(fù)染，封片，光鏡觀(guān)察。每次染色均以PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照。

1.7 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在200倍放大顯微鏡下，zif268mRNA表達(dá)主要在神經(jīng)元胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒物質(zhì)，Zif268蛋白表達(dá)主要在神經(jīng)元胞核顯棕色。在每只大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)隨機(jī)各選擇5個(gè)不重疊視野，雙盲法統(tǒng)計(jì)zif268mRNA或Zif268蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的均值分別記為每只大鼠海馬相應(yīng)區(qū)域zif268mRNA或Zif268蛋白的表達(dá)量，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，記錄后繪制統(tǒng)計(jì)圖。應(yīng)用SPSS 13.0軟件單因素方差分析和Logistic回歸分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀(guān)察 KA注射后平均50min左右大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，最初表現(xiàn)為凝視、顫動(dòng)、點(diǎn)頭等部分性發(fā)作動(dòng)作，隨后出現(xiàn)Racine IV級(jí)或以上發(fā)作，以前肢痙攣旋轉(zhuǎn)、站立傾倒和四肢抽搐等為主，部分出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。假手術(shù)組未見(jiàn)癲癇發(fā)作。

2.2 點(diǎn)燃成功率 參與點(diǎn)燃大鼠共41只，麻醉死亡2只，抽搐出現(xiàn)呼吸抑制死亡3只，點(diǎn)燃成功率為87.8%。假手術(shù)組36只無(wú)死亡者。

2.3 海馬各區(qū)或各時(shí)間點(diǎn)zif268mRNA表達(dá)

正常組和Sham組海馬各區(qū)總體陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率(positive cell count，PCC)無(wú)差異(P ＞0.05)，組內(nèi)比較均為 DG表達(dá)高于 CA1和 CA3區(qū)(P＜0.05)。TLE組海馬各區(qū)均高于Sham組(P＜0.05)，與正常組和Sham組不同，組內(nèi)不同區(qū)域表達(dá)無(wú)差異(P＞0.05);TLE組在點(diǎn)燃后24h海馬zif268mRNA出現(xiàn)表達(dá)高峰，7d最低，在14d和21d有所回升;點(diǎn)燃后6h、24h、14d、和 21d 高于 Sham 組(P ＜ 0.05);在21d海馬各區(qū)zif268mRNA表達(dá)均高于Sham組(P＜0.05)。Logistic回歸分析顯示海馬 zif268mRNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率與顳葉癲癇呈正相關(guān)(β=0.286，P＜0.001)。

2.4 海馬各區(qū)或各時(shí)間點(diǎn)Zif268蛋白表達(dá)正常組和Sham組海馬各區(qū)總體陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率無(wú)差異(P＞0.05)，組內(nèi)比較均以 DG表達(dá)高于CA1和CA3區(qū)(P＜0.05)，與 zif268mRNA表達(dá)一致。TLE組與zif268mRNA表達(dá)不一致，組內(nèi)比較，DG表達(dá)高于CA1區(qū)(P＜0.05)，與CA3區(qū)無(wú)差異(P＞0.05)，組間比較，DG表達(dá)低于 Sham組(P＜0.05);TLE組在點(diǎn)燃后6h海馬Zif268蛋白表達(dá)出現(xiàn)高峰，隨后降低，在14d升高，在21d再次降低;在點(diǎn)燃后24h和7d低于Sham組(P＜0.05)，在14d高于Sham組(P＜0.05);在21d海馬CA1和CA3區(qū)均高于Sham組(P＜0.05)，DG表達(dá)與與zif268mRNA表達(dá)不一致，低于Sham組(P＜0.05)。Logistic回歸分析顯示海馬Zif268蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率與顳葉癲癇呈負(fù)相關(guān)(β =-0.153，P ＜0.001)。

3 討論

與癲癇相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)變化分為早期反應(yīng)和后期反應(yīng)，早期反應(yīng)基因?yàn)榧丛缁?IEGs)，通常編碼轉(zhuǎn)錄因子作為第三信使調(diào)節(jié)后期反應(yīng)基因的表達(dá)，引起長(zhǎng)期慢性表型改變，最終可能導(dǎo)致癲癇的產(chǎn)生和反復(fù)發(fā)作。研究表明，幾乎所有驚厥活動(dòng)均可引起邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元IEGs動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，也包括非邊緣系統(tǒng)，如皮層、紋狀體和丘腦［1］，此外，許多IEGs參與調(diào)節(jié)癲癇后海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷與抗損傷過(guò)程［3］。可見(jiàn)，IEGs活化是致癲過(guò)程的重要環(huán)節(jié)之一［2］。

zif268是一種活性誘導(dǎo)依賴(lài)性表達(dá)的IEGs，是Egr家族成員，編碼82kDa或88kDa的Zif268蛋白，胞漿中的Zif268可被激活為轉(zhuǎn)錄因子ZIF268而移至胞核，ZIF268具有3個(gè)連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)，與調(diào)節(jié)序列 GCGC-TGGGCG結(jié)合，調(diào)控效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄［4］。目前認(rèn)為突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long term potentiation，LTP)構(gòu)成了學(xué)習(xí)記憶的生理基礎(chǔ)，Zif268蛋白是LTP維持階段的必須成分，Zif268缺陷則引起晚相LTP消失，24h后記憶喪失［10］。Zif268失活小鼠會(huì)出現(xiàn)記憶缺失［11］。最近的研究表明，Zif268是背側(cè)海馬記憶重現(xiàn)的再鞏固過(guò)程的必需要素［12］。因此，Zif268可能是調(diào)控記憶相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，Zif268不僅調(diào)節(jié)記憶功能，也參與癲癇后神經(jīng)元的病理?yè)p傷過(guò)程。戊四唑致癇大鼠海馬zif268mRNA表達(dá)增高［6］;電壓依賴(lài)型T型Ca(V)3.2通道與失神癲癇關(guān)系密切，Zif268可直接作用于Ca(V)3.2通道基因啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄［13］;Liang等在運(yùn)動(dòng)皮層注射破傷風(fēng)毒素誘導(dǎo)的大鼠慢性局灶型癲癇，發(fā)現(xiàn)Zif268表達(dá)在注射點(diǎn)增高，在注射點(diǎn)周?chē)档停茰y(cè)Zif268可能對(duì)產(chǎn)生和維持局灶型癲癇起重要作用［7］。由于顳葉難治性癲癇Zif268相關(guān)報(bào)道極少，本研究采用KA杏仁核點(diǎn)燃成功建立了經(jīng)典的顳葉難治性癲癇大鼠模型［8］，并動(dòng)態(tài)觀(guān)察了海馬 zif268mRNA及其蛋白的時(shí)空表達(dá)。

本研究表明，正常海馬各區(qū)zif268mRNA表達(dá)不完全一致，DG表達(dá)高于CA1和CA3區(qū)，Sham組與正常組海馬zif268mRNA區(qū)域分布無(wú)明顯差異，癲癇組海馬 CA1、CA3和DG區(qū)表達(dá)較Sham組增高。顳葉癲癇點(diǎn)燃后zif268mRNA表達(dá)的早期峰值、波動(dòng)幅度和晚期表達(dá)均高于假手術(shù)組。Honkaniemi 等 報(bào) 道［14］，KA 點(diǎn) 燃 后 可 快 速 誘 導(dǎo)zif268mRNA在海馬、皮質(zhì)、杏仁核表達(dá)增高，多數(shù)腦區(qū)24h開(kāi)始逐漸降低至基礎(chǔ)水平，但在CA1、CA3仍保持相對(duì)高水平，與本研究結(jié)果不完全一致。本研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇點(diǎn)燃后遠(yuǎn)期海馬Zif268蛋白在海馬DG存在區(qū)域性表達(dá)降低，提示顳葉癲癇點(diǎn)燃后遠(yuǎn)期海馬DG可能存在Zif268蛋白翻譯效率降低或蛋白穩(wěn)定性降低等蛋白合成紊亂現(xiàn)象，可能與神經(jīng)元死亡有關(guān)［14］。形態(tài)學(xué)資料已經(jīng)證實(shí)癲癇存在苔蘚纖維(mossy fiber，MF)發(fā)芽，并與癲癇的形成及其可塑性的建立密切相關(guān)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，CA3區(qū)神經(jīng)元丟失導(dǎo)致DG顆粒細(xì)胞與自身胞體產(chǎn)生回返性突觸聯(lián)系是MF發(fā)芽的主要機(jī)制。在本研究中，癲癇組21d海馬DG區(qū)zif268mRNA與其蛋白表達(dá)偏離，提示DG區(qū)可能存在較為長(zhǎng)期的蛋白合成紊亂、較為嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷和較少的神經(jīng)元再生，神經(jīng)修復(fù)機(jī)制可能被過(guò)度激活，可能是海馬MF發(fā)芽的病理基礎(chǔ)或反映。回歸分析提示顳葉癲癇與海馬zif268mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，與Zif268蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示海馬即早基因zif268及其蛋白的時(shí)空表達(dá)變化可能參與KA點(diǎn)燃顳葉癲癇病理過(guò)程。

總之，顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制可能是一系列生物學(xué)事件級(jí)聯(lián)結(jié)果，其中IEGs表達(dá)是其中的重要環(huán)節(jié)之一。我們過(guò)去研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇大鼠存在空間記憶能力損害［8］，推測(cè)海馬zif268及其蛋白時(shí)空表達(dá)改變可能是顳葉癲癇記憶損害的途徑之一，還有待進(jìn)一步研究。

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