分子生物學技術應用于木材識別的研究進展

伏建國，劉金良，楊曉軍，安榆林，駱嘉言

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京210001； 2.南京林業大學 木材工業學院，江蘇 南京 210037)

木材是世界四大原材料(木材、鋼鐵、水泥、塑料)之一，是人類賴以生存和發展的寶貴資源，也是國民經濟和社會發展中難以替代的戰略性資源。20世紀90年代以來，隨著世界木材消費量的快速增長，木材資源的短缺和匱乏日益顯現，非法砍伐和貿易嚴重破壞了林木資源的可持續利用。為了保護森林資源，很多國家出臺了保護森林的法規和政策，對木材的合法性提出了要求，如美國的《雷斯法案》(2008年修訂案)要求，所有輸美的木制品都應提供木材供應的合法來源，包括使用的植物種類的拉丁名、采伐的國家、數量、價值等。因此，木材樹種的鑒定及來源的識別對于保護森林資源，促進木材及木制品貿易的健康發展等方面意義重大。傳統的形態學方法只能鑒定木材的種類(通常鑒定不到種的水平)，無法識別木材的來源。隨著分子生物學技術的發展，分子標記及DNA條形碼技術開始應用于木材樹種的鑒定及來源識別[1]。為了讓更多的人了解該項技術，方便木材科學研究者開展分子識別方面的研究工作，筆者對分子生物學技術在木材識別領域的發展及應用進行了歸納和總結，從木材DNA提取、木材樹種分子鑒定及木材來源地的分子驗證技術3個方面的研究進展進行概述。

1 木材DNA提取技術

1.1 木材DNA提取常用的方法

對于新鮮植物組織的DNA提取，已有成熟的方法，如很多商業試劑盒及十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[2]都可以完成高質量DNA的提取，而木材DNA的提取方法目前仍處于試驗和摸索階段。自1998年De Filippis[3]利用改良的CTAB法成功提取刺槐Robinia pseudoacacia木材DNA以來，后繼學者多采用改良的 CTAB或商業試劑盒(多采用DNeasy Plant Mini Kit)先后從櫟屬 Quercus spp.[4－5]，松屬Pinus spp.[6]，棱柱木 Gonystylus bancanus[7]，龍腦香科 Dipterocarpaceae[8]等多種木材中提取出可滿足聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的DNA，這些改良措施主要有以下2個方面。

1.1.1 樣品前處理 針對木材DNA容易污染、降解、含量低等難點，提取木材DNA時，多數學者都改良了相應的前處理措施。為了避免或減少外源DNA污染，木材DNA提取最好在潔凈無菌的環境下操作，采取相應的表面消毒措施或去除表層木材樣品[4,6]。為了減少提取過程中DNA進一步降解，木材樣品在破碎過程中應避免溫度太高，多在液氮冷凍下破碎。木材中DNA含量低，為了讓有限的DNA充分釋放，樣品破碎盡量徹底，在DNA抽提液中水浴時間一般較長，很多研究采用65℃水浴過夜[7,9]。

1.1.2 加入去除PCR擴增抑制物質 木材DNA中很多抑制PCR擴增的物質難以去除，改良方法中多采用向提取液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蛋白酶K、巰基乙醇等物質去除木材DNA中抑制PCR擴增的物質。現有研究表明，加入PVP去除抑制物效果較為明顯[6,9]。但對于PVP的用量，目前沒有統一標準，沒有學者對此進行專門的比較研究。除了PVP外，加入N-phenacylthiazolium bromide(PTB,C11H10BrNOS)也被證實能夠顯著提高木材DNA提取質量。多聚嘧啶序列結合蛋白(PTB)常用于古木材DNA 提取[10－11]，去除梅拉德反應物，有利于 DNA 的釋放[12]。Asif等[7]利用 CTAB 和 DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)試劑從干燥處理過的棱柱木中獲得DNA產量和質量都很低，無法實現PCR擴增，加入PTB后，提取的DNA可以擴增出800 bp的葉綠體DNA片段。Tang等[13]也證實了PTB不僅提高了DNA獲取量，同時明顯提高了擴增成功率。利用PTB方法，砍伐4 a，自然干燥，經過處理的白橡木Quercus fabri，仍然能夠擴增出1 000 bp的片段。

1.2 木材DNA提取取得的進展

2000年以前，由于木材識別主要是通過宏觀特征及顯微特征相結合的形態學鑒定方法，且多數人認為無法從木材中獲得滿足分子生物學鑒定所需的DNA，因此，關于木材DNA提取及分子鑒定領域的研究極少。隨著De Filippis等[3]和Dumolin-Lapègue等[5]分別從新鮮和干燥的木材中提取出可用于普通PCR擴增的DNA后，關于木材DNA提取的文章及報道越來越多，木材DNA的提取取得了以下進展:①多個樹種的木材DNA提取獲得成功。由于不同種類木材的物理結構及所含的化學物質存在一定的差異，適合某一樹種木材DNA提取方法也許并不適用于其他樹種。據報道，目前已從殼斗科Fagaceae[4－5]，龍腦香科[8]，松科 Pinaceae[6]，豆科 Leguminosae[3]，瑞香 科 Thymelaeaceae[7]，杉科 Taxodiaceae[13]，木 犀科Oleaceae[13]等多個科的木材中提取出可用于PCR擴增的DNA，證明了木材DNA提取及分子鑒定的光明前景。②從處理過的木材中提取DNA獲得成功。熱處理、化學處理、紫外線照射等都會加速木材D NA降解[9]，相對于新鮮木材，從處理過的木材中提取DNA更加困難。目前，從處理后的木材中提取 DNA獲得了較大突破，Dumolin-Lapègue等先后從干燥處理過的木材中提取出可用于PCR擴增的DNA[4－5，8]；Deguilloux等[14]從經過高溫和化學處理過的成品橡木桶中提取出DNA，能夠滿足橡木桶來源地的分子生物學識別；Reynolds等[6]從水浸處理后的木材中提取出DNA，并擴增出400 bp的葉綠體基因片段和600 bp的核糖體基因片段。③從古木中提取DNA獲得成功。樹木自砍伐后，木材DNA快速降解，因此，木材存儲的時間越長，提取DNA的難度越大。但是，近年來的研究表明:從一些年代久遠的木材中仍然可以提取到DNA。1999年，Deguilloux等[5]從600 a前的橡木中提取出DNA，并擴增出290 bp的葉綠體片段；2006年，Deguilloux等[15]從公元260年前的橡木中提取出可用于遺傳分析的DNA；2006年，Liepelt等[16]從11 500 a前的古木中提取出DNA，并通過葉綠體Trn區域的擴增將它鑒定到屬的水平。

2 木材樹種分子鑒定技術

傳統的木材樹種鑒定技術建立在木材解剖學基礎上，主要通過木材宏觀及微觀特征相結合的方法實現，對鑒定者的鑒定知識和經驗要求較高，一般只能確定到屬的水平，很難鑒定到種的水平。隨著分子生物學技術的發展，DNA分子標記及DNA條形碼等技術開始應用于木材樹種的分子鑒定，給木材鑒定技術帶來了新突破。

2.1 利用微衛星標記鑒別木材樹種

微衛星，又稱簡單序列重復(simple sequence repeat，SSR)，最初是由Tautz等[17]在1984年發現，1989年Litt等[18]命名為微衛星(microsatellite)。微衛星標記的原理是由幾個核苷酸(1～6個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，如(GA)n，(AC)n，(GAA)n等，在染色體上呈隨機分布，由于重復次數不同及重復程度的不完全而造成了每個基因座上等位基因的多態性。由于微衛星具有高度的多態性，目前已被廣泛應用于植物種質資源的鑒定，同時也是木材樹種鑒定的有效工具。Dumolin-Lapègue等[5]利用葉綠體微衛星差異，成功地把紅橡木Quercus rubra和白橡木2個樹種的木材區分開來。Rachmayanti等[8]研究結果表明，利用葉綠體SSRs，能夠將龍腦香科的5個不同樹種的木材區別開來。由于微衛星技術需要進行微衛星座位的篩選和特異引物的開發，需要大量的前期研究工作，目前在木材樹種鑒定中應用的并不廣泛。

2.2 利用單核苷酸多態性鑒別木材樹種

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。1996年，由Lander[19]首先正式提出使用SNPs為新一代分子標記，隨后在物種鑒定、物種起源與親緣關系、遺傳育種等領域得到了廣泛的應用。1999年，Germano等[20]利用SNPs技術成功區分了在形態上難以區別的紅云杉Picea rubens，黑云杉P.mariana和白云杉P.glauca等3個近緣種。Fladung等[21]利用SNPs將楊屬Populus不同種及其雜交種成功區分開來。隨著木材DNA提取技術的日益成熟，SNPs開始應用于木材樹種的鑒定及來源地的驗證。2008年，Ogden等[22]通過擴增matK，ropC1，ropB，accD和ndhJ等5個葉綠體基因片段，發現棱柱木屬Gonyslylus多個SNPs位點，其中matK含有的SNPs最多，最后篩選出該屬7個種共有的1個SNP位點設計探針和引物，能夠將該屬的木材與其他屬木材區分開來，為防止該屬木材被非法貿易提供了快捷準確的鑒定工具。

2.3 利用DNA條形碼技術鑒別木材樹種

DNA條形碼技術(DNA barcoding)是利用一段或幾段標準的、易擴增的、種間差異顯著大于種內差異的DNA片段來鑒別物種的新技術，該概念最早由加拿大學者Hebert提出[23]。由于DNA條形碼技術具有操作簡單、不受個體發育階段和形態特征的限制、鑒定快速準確等諸多優點，該技術目前已在動植物分類鑒定研究中得到較為廣泛應用[24－28]。木材的形態學鑒定需要專業技術及豐富的經驗，一般人很難勝任，DNA條形碼技術給木材鑒定領域帶來了光明的前景。Liepelt等[16]利用該技術將1萬年前的古木鑒定到屬的水平，Asif等[7]和Tang等[13]用該方法實現了對干燥或處理過的木材樹種進行了初步鑒定。由于木材DNA質量不高，很難擴增出長的片段，因此選擇合適的DNA條形碼是鑒別木材樹種的關鍵。在植物中，葉綠體基因組具有進化快、單親遺傳、變異穩定等優勢[29]，植物DNA條形碼篩選主要集中在葉綠體基因組中[24－27]。又由于木材中葉綠體拷貝數多，獲取目標DNA幾率大，是鑒定木材樹種最佳選擇。因此，木材DNA提取方法的研究也通常采用能否擴增出葉綠體基因組中一些候選條形碼片段作為檢驗 DNA 提取質量的標準[4－5，9，13]。

3 木材來源地的分子驗證技術

非法砍伐是造成森林資源遭受破壞的主要原因之一[30]。為了保護森林資源，阻止非法砍伐，很多國家要求出口商提供木材的合法來源。形態學方法只能鑒定木材的種類，而無法識別木材的來源。由于樹木是多年生植物，基因漂移、雜交等多種因素致使種群間存在很高的遺傳多樣性[31]，通過對不同群體遺傳多樣性的詳細分析就可以驗證某一木材是否來源于某一群體。因此，分子遺傳學可用于木材來源地的驗證。

目前，利用分子生物學技術驗證木材來源地的研究很多，但多數研究仍處于試驗階段[32－34]，僅有少數的研究成果在實際鑒定中得到了應用。葡萄酒的品質與儲存葡萄酒的橡木桶產地具有一定的關系，橡木來源地的鑒定對葡萄酒的真偽和質量的鑒定具有實際意義。2004年，Deguilloux等[14]從法國10個不同的制桶企業抽取了131個橡木樣品，通過DNA提取及葉綠體DNA標記的擴增來檢測不同樣品的基因型，從而確定其真實的來源地是否與制桶企業聲稱的來源地一致。研究結果發現，絕大多數抽檢橡木的來源地與企業聲稱的相一致，但有一些聲稱來自法國的橡木被檢測出來源于東歐，一些號稱來源于著名產區的橡木其實來自普通產區。木材來源地的鑒定對于保護娑羅屬Shorea樹種具有重要意義，2006年，Cao等[35]年利用擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)技術發現了印度尼西亞境內不同種群的娑羅屬樹種Shorea leprosula存在明顯的差異。由于AFLP對DNA質量的要求較高，不適合用于木材的識別。2009年，Nuroniah[36]將AFLP標記轉換成序列特異性擴增區(sequence characterized amplified region，SCAR)標記，建立了印尼波羅洲和蘇門答臘2個地區Shorea leprosula的分子標記，從而可以驗證Shorea leprosula木材是來自波羅洲還是蘇門答臘。

4 問題與展望

高質量DNA的提取是木材分子識別的前提，木材DNA的成功提取為分子生物學技術在木材識別中的應用奠定了堅實的基礎，10余年的研究結果也表明了分子標記技術在木材識別領域應用的可行性及其光明前景，但由于該領域的研究仍處于初期階段，還面臨很多困難和挑戰。木材DNA提取還存在以下幾個方面的問題:①提取方法仍在摸索階段，不同種類通常需要不同的處理，沒有統一規范的提取方法。②獲得的DNA質量總體不高，DNA降解問題難以解決，通常只能擴增出短片段序列[4]。③DNA中混雜的PCR擴增抑制物質難以去除，對后續研究影響較大[37]。④一些年代久遠、經過加工處理或保存不當的木材中無法提取出可用于分子研究的DNA。在木材分子鑒定方面，也同樣存在很多需要解決的問題:①缺乏大量的分子遺傳學研究基礎。用于鑒別木材的分子標記需要前期通過對大量樣品的遺傳差異研究來獲得，Deguilloux 等[14]橡木桶來源地的鑒定是建立在 Petit 等[38]和 Deguilloux 等[39]對歐洲 2 600 個歐洲橡樹種群葉綠體DNA研究基礎上的，這項工作不僅花費較高，且費時費力。②目前的研究僅僅解決了少數幾個種的材種鑒定，或者是有限范圍內的來源地驗證，更多種類及更大范圍內的木材識別驗證還需更深入地研究，需要積累大量樹種的DNA信息。③很多的遺傳標記是在植物葉片提取的高質量DNA基礎上篩選出來的，在木材DNA中并不適用，通常需要針對木材DNA的特點開發和篩選合適的分子標記。雖然木材分子識別還有很多困難需要克服，但鑒于木材對于人類的重要性及保護森林資源的迫切性，該技術具有很高的應用價值及市場前景，越來越多的機構及學者投入了這一領域的研究工作[1，32－34，40－41]。隨著植物DNA條形碼技術的發展[42]及高通量測序技術的不斷突破[43]，以上困難和問題將會逐步得到解決，木材分子識別將會成為一種成熟的常規技術而被廣泛應用。

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