補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視神經BDNF改變的影響

李翔 李娟 張靜 王桃 楊東梅 王超

青光眼(glaucoma)是一類以特異性視神經萎縮和視野缺損為共同特征的眼病。探討青光眼視神經損傷的作用機制,有助于保護視功能。本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈法誘導產生眼壓維持穩定、持續時間較長的慢性高眼壓動物模型[1],通過觀察補腎活血中藥(杞菊地黃丸和復方丹參片合用)對EIOP大鼠眼壓及視神經腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophin factor,BDNF)表達的影響,探討其保護視功能的作用機理,為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

標準1級SD大鼠30只,雌雄不拘,8～12周齡,體重約150～200g,等價飼料飼養,大鼠及飼料均由成都中醫藥大學實驗動物中心提供。飼養室溫20～25℃,空氣流通,相對濕度55%～75%,12小時光照維持,晝夜循環。自由攝食飲水。納入標準:①無外眼疾病;②雙眼瞳孔直接對光反射和間接對光反射正常;③無歪頸。

1.2 藥品與試劑

復方丹參片(批號7122426)、杞菊地黃丸(批號7072153)均購于北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠。BDNF多克隆抗體(批號BA0565),購于博士倫生物工程有限公司。

1.3 造模方法

SD大鼠購回后,適應性喂養3天,進行眼壓測量,正常眼壓區間估計,取平均眼壓在9～18mmHg者,隨機分為空白組、模型組、給藥組,模型組和給藥組進行單眼(右眼)造模,左眼不做處理。方法如下:大鼠稱重及固定后,用3%戊巴比妥鈉按1.5ml/kg體重行左下腹腔注射全身麻醉,同時術眼予0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液角結膜表面麻醉,于10點至2點鐘位距角鞏膜緣1～2mm剪開上方球結膜,分離筋膜,暴露角鞏膜緣后3～4mm近赤道部10點、12點和1點處3支上鞏膜靜脈并烙閉,整復球結膜,術眼涂金霉素眼膏,待大鼠蘇醒后放回籠內,0.25%氯霉素眼液滴眼,2次/日,連續6天。假手術組(空白組)右眼眼科手術止血器不開開關而不起烙閉作用,其余操作相同。因為灌胃等原因動物死亡4只。

1.4 分組與給藥方法

將以上各組大鼠連續給藥8周,方法如下:空白組、模型組每天予3ml生理鹽水灌胃;給藥組每天灌胃予0.96g/kg體重的復方丹參片、3.0g原生藥/kg體重的杞菊地黃丸的混懸液,相當于20倍成人劑量;每天同一時間灌胃1次,連續灌胃8周。每2周稱大鼠體重1次,調整給藥量。

1.5 眼壓檢測

均在每天的同一時間(2:00pm～5:00pm)進行。待測眼鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后,用TONO-PEN筆式眼壓計連續測量術前3天眼壓,取平均值作為正常眼壓;術后即刻、術后一周、術后二周、術后四周、術后六周、術后八周各測一次大鼠右眼眼壓,共8周。

1.6 BDNF免疫組化檢測

于造模8周后以頸椎脫臼法處死大鼠,切取后極部包括視乳頭和視神經在內的組織塊,立即放入復合固定液(75%酒精850ml、10%甲醛100ml、5%醋酸50ml混合液)中,固定72h后,標本逐級酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,于球后2～4mm處,做4μm連續切片,烘干備用。染色步驟:所用抗體為大鼠BDNF多克隆抗體;石蠟切片脫蠟至水;3%H2O2室溫孵育5～10min;蒸餾水沖洗,PBS浸泡5min;5-10%的正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10min,傾去血清,勿洗,滴加適當比例稀釋的一抗,37℃孵育1-2h;PBS沖洗,5min×3次;滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10～30min;PBS沖洗,5分鐘×3次;滴加適當比例稀釋的辣根酬酶標記鏈霉卵白素(PBST稀釋),37℃孵育10～30min;PBS沖洗,5分鐘×3次;顯色劑顯色(DAB或AEC);自來水充分沖洗,復染,封片。大鼠BDNF多克隆抗體進行BDNF免疫組化染色,結果判定及半定量分析:BDNF染色的組織內出現細顆粒狀、細絲狀棕黃色著色為BDNF陽性染色。每張切片隨機選3個視野,每組共18個視野,用 Mias-2000型圖形圖像分析儀測量視神經部位BDNF陽性染色灰度,求取每視野均值代表該切片的測量值,分別表示BDNF的表達強度。

2 統計方法

3 結果

3.1 各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較(見表1):

表1 各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較±s)(單位:mmHg)

Note:與造模前相比,△P<0.01;與空白組相比,▲P<0.01

由表1可見:造模前各組大鼠IOP相比較無統計學意義(P>0.05),造模后即刻,模型組和給藥組與空白組相比較有統計學意義,說明造模成功(P<0.01),而模型組和給藥組眼壓之間無統計學意義(P>0.05),具有組間均衡性;用藥后8周,模型組、給藥組與空白組及造模前眼壓比較有統計學意義(P<0.01),表明高眼壓維持良好,模型組與給藥組眼壓比較無統計學意義(P>0.05),但給藥組有降低趨勢。

3.2 補腎活血中藥對EIOP大鼠視神經BDNF表達的影響(見表2):

表2 各組大鼠視神經BDNF表達比較

Note:與空白組相比,▲P<0.05;與模型組相比,△P<0.05

圖1 空白組BDNF染色 圖2 模型組BDNF染色 圖3 給藥組BDNF染色

由表2、圖1-3表可見:造模后,大鼠視神經BDNF表達總面積、平均光密度、積分光密度均顯著降低(P<0.05)。而給予補腎活血中藥后,BDNF表達總面積、平均光密度、積分光密度均有所恢復,與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05),與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05),提示慢性EIOP引起大鼠視神經的BDNF表達減少,補腎活血中藥可對BDNF表達恢復有作用。

4 討論

青光眼是一個多因素疾病,其發病機制尚未完全清楚。但是不管發病機制是什么,最終導致青光眼視功能損害的病理基礎是視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)的進行性凋亡及視神經纖維的丟失[2],臨床中即使眼壓控制到正常范圍,視野缺損和RGCs的凋亡仍在繼續,因此視神經的保護很重要。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophin factor,BDNF)是一種具有抑制神經元死亡功能的堿性蛋白質,與神經元的發育、分化、正常存活與功能表達、程序化死亡等有關;可促進受損神經元的存活與再生,還可預防或改善某些神經元的病理過程[3]。BDNF是神經系統最主要的神經營養因子之一,有很強的刺激和促進神經細胞生長、分化,促使損傷細胞修復作用。BDNF還能促進神經元突起的可塑性,例如增加突起的密度,促進包括軸突和樹突在內的突起生長[4],除廣泛分布于中樞神經系統和感覺神經及骨髓運動神經元,BDNF主要在視網膜光感受器細胞層、內核層、神經節細胞和神經纖維層中表達,大部分由視網膜自身分泌,對RGCs的存活起重要作用。目前對于RGCs凋亡的認識中已得到廣泛認同的一個誘發因素就是神經營養因子,尤其是BDNF的剝奪[5]。當視神經損傷后,RGCs本身存在保護性反應,其表現之一就是BDNF及其受體的表達增高。所以,選擇視神經部位的BDNF表達作為觀察指標對說明視功能保護的機理具有一定的作用。

青光眼屬中醫“五風內障”范疇,其視功能損害導致的特異性視神經萎縮和視野缺損類似于“青盲”,我們的前期研究已經從視網膜、視中樞角度觀察了補腎活血對青光眼視功能保護的作用及機理,結果顯示:補腎活血中藥(杞菊地黃丸和復方丹參片合用)可以抑制EIOP大鼠視網膜神經纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)和視網膜神經節細胞層(retinal ganglion cells layer,RGCL)變薄,改善RGCs超微結構,防止RGCs和RNFL損害,有助于多焦視網膜電圖(multifocal electroretinogram,mfERG)總波及1、2、3、4環P1波反應密度、總波P1波峰潛時、2環及3環N1波反應密度,3環、4環N1波峰潛時的恢復[6,7],上調RGCs抗凋亡基因Bcl-2、抑制凋亡促進基因Bax[8],并可修復初級視皮質(primaryvisualcortex,PVC)及外側膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)的損傷,提高EIOP大鼠PVC及LGN的BDNF表達[9,10]。臨床觀察也發現,加用補腎活血中藥(杞菊地黃丸和復方丹參片合用)后,青光眼患者的視功能可以得到不同程度的改善[11,12]。

本研究通過觀察慢性EIOP大鼠視神經部位的BDNF表達改變,進一步探討補腎活血中藥對青光眼視功能保護的作用機理。結果發現,慢性高眼壓可導致大鼠視神經BDNF表達低下,而補腎活血中藥對模型大鼠視神經的BDNF表達具有恢復作用,從而對視神經起到保護作用。杞菊地黃丸為經典古方,為滋補肝腎明目的代表方劑,復方丹參片活血化瘀通絡,兩者均為《中國藥典》載入藥品、非處方用藥,價廉物美,服用方便,可作為臨床青光眼視神經保護藥物推廣應用。

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