實驗動物眼底血管熒光造影的研究進展

陳俊宏 李強 段俊國

眼底血管熒光造影(fundus fluorescein angiography,FFA)是一項最常用的眼底病變診斷技術,已成熟地在臨床上應用。一般選擇前臂正中靜脈快速注射熒光素鈉,注射后10～15s,開始每秒攝一張照片,直到循環結束[1]。其不但直觀地、動態地觀察眼底血管形態和病灶部位,而且可以記錄檢眼鏡看不到的色素上皮和視網膜的循環的細節,對各種眼底疾病的診斷、鑒別診斷、臨床治療及預后都具有重要意義。在實驗研究中,大部分眼底病動物模型的建立和藥物治療的作用效果都需要通過FFA評估。理想的FFA方法應具有操作簡便、成功率高、各循環時間準確和熒光顯影強等特點,但由于動物生理結構特點,不同方法的FFA各存難點。根據給藥途徑,實驗動物FFA方法可分為:經尾靜脈注射、腹腔注射、球后注射和口服給藥行眼底血管熒光造影。

1 經尾靜脈注射熒光素鈉

尾靜脈注射和人的肘正中靜脈一樣,直接進入體循環,可以迅速獲得高濃度血中熒光素鈉,故顯影最強。缺點有:直接進入體循環易引起過敏;注射量過大易引起充血性心衰[2];尾靜脈較細,對注射技術要求高,注射成功率偏低,反復注射易影響尾靜脈-眼循環時間的統計。熟練的操作、使用較細的針頭以及用溫水浸泡尾部以擴張血管可以提高注射的成功率。張遷等在實驗中給健康SD大鼠尾靜脈注射100g/L熒光素鈉注射液0.5ml/kg,經共焦激光眼底血管造影儀觀察,最小可以看到4級血管(自視盤分枝算1級血管),并根據眼底血管的充盈和顯像情況將循環分為早期相(注射后1～3s,可見1級血管),中期相(3s～5min,可見小血管,最小到4級血管),后期相(熒光素鈉注入5min以后,視網膜血管顯像和逐漸變亮的背景)[3]。趙英杰等報道,Wistar大鼠尾靜脈注射最適劑量為40mg/kg(10%立攝得),尾-視網膜循環時間為6.6±3.0s,靜脈層流時間為7.6±3.0s,視網膜靜脈充盈時間為9.3±3.5s,視網膜循環時間為2.1±0.58s,熒光消退時間為18.1±5.1min[4]。

2 經腹腔注射熒光素鈉

熒光造影劑注射后,經腹膜吸收進入體循環后到達眼球。腹膜吸收較緩慢,在短時間內視網膜熒光素鈉濃度較低,故造影顯影強度較弱,但持續時間較長。優勢在于其操作簡便,成功率極高,易于各組間循環時間的對比。趙英杰等發現,Wistar大鼠腹腔注射最適劑量為120mg/kg(10%立攝得),動靜脈開始充盈時間為40.9±4.80s。熒光消退時間為20.4±2.70min[4]。李明銘等試驗中,給氬激光誘導的脈絡膜新生血管模型C57BL/6J小鼠腹腔注射1%熒光素鈉0.3 mL后,觀察激光滲漏以間接觀測新生血管[5]。李岱等向半導體激光誘導的BN大鼠按0.5ml/kg向腹腔注射的10%熒光素鈉以觀察新生血管,視網膜顯影至注射后的30min[6]。

3 經左心室內注射異硫氛酸葡聚糖熒光素鈉

異硫氛酸葡聚糖熒光素鈉是一種較高相對分子質量的熒光,不能穿過血管壁,到達視網膜血管后停留在血管壁上。此法重復性好,血管顯影清晰、完全[7]。缺點是操作相對其他方法復雜,且必須處死動物,不能連續性觀察不同時期同一個動物的眼底病變過程。此法將大鼠麻醉后,把異硫氛酸葡聚糖熒光素50 mg,溶于1ml的4% 多聚甲醛,直接左心室灌注,灌注后立即摘除眼球,放入4 % 多聚甲醛固定5 h,游離出視網膜,以視乳頭為中心放射狀切片、 鋪片,滴少量甘油明膠,加蓋玻片,熒光顯微鏡觀察,并用數碼照相機拍片,可以清楚觀察到從中央部延續到周邊部的整個視網膜血管形態、走行[8]。

4 經球后注射熒光素鈉

球后注射后,熒光素鈉由鞏膜、脈絡膜逐層向內彌散的過程中,在背景發亮的熒光襯托下可以顯現視網膜脈、絡膜及血管清晰輪廓,是一種“光化學鞏膜透照法”。張四力等報告,家兔球后注射后30秒～30分鐘立即可見到背景亮度增強,隨即出現地圖狀強螢光襯托出脈絡膜血管的陰影,到10分鐘時,出現全亮背景。晚期出現全亮背景及視乳頭著色,基本同于靜脈法的晚期影象[9]。主要是脈絡膜及脈絡膜血管顯影,可以作為脈絡膜占位性病變和脈絡膜血管病變的輔助診斷方法。此法成功率高,操作簡便。但近年使用較少,主要由于視網膜血管顯影不明顯。

5 口服熒光素鈉

口服熒光素鈉后,通過胃黏膜吸收進血液入體循環后到達眼球。此法在1979年Kelley等首先報道后,已應用于臨床。主要應用于一些有過敏史者、小兒老人血管不易尋找者或其他病史不能行靜脈給藥的患者。優點是簡便、易行,適用于普查,幾乎不發生過敏反應。缺點是由于胃一視網膜時間受多種因素影響[10],故視網膜出現熒光時間不具參考性;視網膜熒光沒有靜脈注射法顯影強。Kelley明確指出人口服法滲漏從15 分鐘開始顯現,到1小時明顯,到1小時的影象相當于靜脈法7 分鐘左右的影象[11]。此法應用于動物較少。張四力等給家兔應用此法,視網膜,脈絡膜始終未見到明顯的血管顯影,但背景的亮度是逐浙增強的[9]。

6 小結

可行性、準確性、可重復性是科學實驗的基本要素。如何確保實驗動物FFA的可行性、準確性和可重復性,是實驗最值得探討的難題。以上FFA方法各有優劣,應該根據動物種類、實驗目的、病變部位等差異選擇最合適的造影方法,不應該盲目地應用統一的標準。比如大鼠由于血管較大,浸泡后能充分暴露,可以選擇尾靜脈注射法,小鼠選擇尾靜脈注射難度較大,更適合用腹腔注射法;如果我們要求對比不同組別動物的前期、動脈期、靜脈期和晚期的差異,尾靜脈注射法難以把握注射的準確性,影響各循環時間的計算,更適合用腹腔注射法以減少人為操作對各期時間的影響;病變在視網膜及其血管,靜脈注射法顯影最強,腹腔注射次之;病變在脈絡膜,適合用球后注射和口服法;到實驗的終末期,可以處死動物,經左心室內注射異硫氛酸葡聚糖熒光素行視網膜血管造影法將獲得更直觀、血管顯影清晰、全視網膜造影范圍的圖片。

[1] 段俊國.中西醫結合眼科學[M].北京:中國中醫藥出版社,2005:71.

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[3] 張遷.大鼠視網膜微循環及白細胞運動初步研究[D].西安:第四軍醫大學,2009:3-6.

[4] 趙英杰.視網膜脈絡膜熒光血管造影的實驗研究[D].成都:華西大學,2004:1-9.

[5] 李明銘,王康,劉玉宣.氬激光誘導小鼠脈絡膜新生血管形成[J].首都醫科大學學報,2008,10,29(5):622-625.

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[7] D’Amato R,Wesolowki E,Smith EH Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the Mouse,Microvasc res,1993,46:135-142.

[8] 孔怡淳,韓梅,趙堪興,等.小鼠視網膜新生血管模型熒光素灌注造影[J].中華眼科雜志,2006-2007,42(7):634-636.

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[10] 陳共和,何志遠,趙坤明.口服法眼底熒光造影術初步觀察[J].廣東醫學雜志,2003,23(4):236.

[11] Jamess Kelley.etal:Retinal fluhorography using oral fluoescein[J].Ophthalmology,1980,87(8):805.