柴胡皂苷-d抑制大鼠肝星狀細胞增殖的實驗研究

路 賽，張詩劍，李 靜，王紅艷，周利嬌，李素婷

(1.承德醫學院2011級，河北承德 067000;2.指導教師)

柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分，根據其化學結構不同可分為a、b、c、d等，其中以柴胡皂苷d(SS-d)藥理作用最強。整體研究表明，SS-d對肝纖維化有一定的防治作用[1]。本實驗擬以體外培養大鼠肝星狀細胞，觀察SS-d對體外培養肝星狀細胞增殖的抑制作用，并確定其抑制作用的最佳濃度和最佳時間，以期為SS-d抗肝纖維化的進一步研究提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 肝星狀細胞株HSC-T6，購自凱基生物有限公司;DMEM高糖培養基，購自GIBCO公司;胎牛血清，購自Hyclone公司;MTT，購自SIGMA公司;DMSO，購自上海生工。CO2培養箱:日本Taibai LNA-122D;倒置顯微鏡:德國Olympus;酶標儀:日本BIO-RAD;離心機:上海TGL，16G。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝星狀細胞培養:大鼠肝星狀細胞株HSC-T6，以含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2混合氣體的CO2培養箱中培養，細胞換液時間為1-2d，待細胞長滿后用0.25%的胰酶消化，按1:2或1:3傳代培養。

1.2.2 細胞分組與藥物處理:細胞傳代穩定后，大鼠肝星狀細胞隨機分為空白對照組和SS-d不同劑量組，每組設3個復孔。SS-d組分別給予不同劑量的SS-d，使終濃度 分 別 達 到0.625mg/L、1.25mg/L、2.50mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80.0mg/L，空 白 對 照 組常規培養。

1.2.3 MTT法檢測不同濃度SS-d對HSC增殖的影響:調整細胞計數為1×105后，均勻接種于96孔培養板中培養，每孔總容積為200μl，各組細胞培養至70%-80%次融合時，0.4%胎牛血清DMEM培養基同步化處理細胞12h后，更換為完全培養基。SS-d組給予不同濃度SS-d，空白對照組加等體積培養基。各組培養24h后，加入5mg/ml MTT20μl，37℃孵育4h，吸棄孔內培養液，各孔加入二甲基亞楓200μl，低速震蕩1h，以溶解被還原的MTT結晶，酶標儀雙波長檢測各孔吸光度值，按下列公式計算大鼠HSC增殖抑制率。細胞抑制率=[1-(實驗組A值/對照組A值)]×100%。

1.2.4 MTT法觀察不同刺激時間SS-d對HSC增殖的影響:肝星狀細胞計數、接種于96孔板中培養同上。選擇抑制效果最好的SS-d(2.5、5.0、10.0mg/L)，分別作用12h、24h和36h，對照組加等體積培養基。各孔加5mg/ml MTT20ul，37℃孵育4h，吸棄孔內上清液，各孔加入二甲基亞楓200ul，低速震蕩1h，以溶解被還原的MTT結晶，酶標儀雙波長檢測各孔吸光度值，計算不同時間點SS-d對HSC增殖的抑制作用。

2 結果

2.1 MTT法觀察不同濃度SS-d對HSC-T6生長的抑制作用 MTT法檢測結果顯示，SS-d對大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)的生長有抑制作用，隨著SS-d濃度增加，抑制作用明顯增加，并呈現量效依賴性(見表1)。但當濃度增加到20mg/L以上時，抑制作用在提高，但細胞存活率小于50%，提示SS-d濃度增加到20mg/L以上時，因SS-d濃度過高對HSC產生毒性作用。因此，選擇SS-d抑制肝星狀細胞增殖最明顯且細胞存活率較高的濃度(2.5、5.0、10.0mg/L)作為最佳實驗濃度。

表1 不同濃度SS-d對HSC-T6細胞生長的抑制作用

2.2 MTT法檢測SS-d作用不同時間點對HSC生長的抑制作用 選擇SS-d對HSC增殖有抑制作用的的最佳濃度，分別作用12h、24h和36h，MTT檢測結果顯示，SS-d在2.5、5.0、10.0mg/L 范圍內作用12h、24h、36h，隨著作用時間的延長，抑制作用呈明顯的時效和量效關系。見表2。根據實驗結果，選擇2.5、5.0、10.0mg/L濃度范圍作用24h為最佳濃度和最佳時間。

表2 SS-d作用不同時間對HSC-T6增殖的抑制作用(±s)

表2 SS-d作用不同時間對HSC-T6增殖的抑制作用(±s)

相同時間不同劑量之間與前一組比較:aP＜0.05;相同劑量不同時間，24h與12h之間與前一組比較:bP＜0.05。

組別 濃度(mg/L)12h 24h 36h對照組 - 1.245±0.032 1.362±0.070 1.456±0.081 SS-d組 2.50 0.976±0.062a 0.968±0.064a 0.963±0.073a 5.00 0.863±0.062ab 0.856±0.061ab 0.854±0.031a 10.0 0.750±0.051ab 0.711±0.038ab 0.708±0.062a

3 討論

肝纖維化是由于肝細胞慢性損傷、炎癥和不斷地組織重建，造成細胞外基質的大量分泌和廣泛沉積所致。目前認為，肝星狀細胞是肝臟生成細胞外基質的主要細胞，各種刺激因素通過細胞因子介導細胞信號通路激活肝星狀細胞，使其大量增殖并發生表型轉化，分泌大量細胞外基質沉積于肝臟，是肝纖維化形成并發展到肝硬化的關鍵環節[2]。尋找有效藥物抑制HSC活化增殖，是逆轉肝纖維化、防治肝硬化發生的重要策略。SS-d是中藥柴胡的活性成分之一，實驗證明SS-d可抑制肝細胞內細胞外基質基質的合成，對腎小球系膜細胞的增殖具有一定的抑制作用[3-4]。本實驗觀察SS-d對體外培養大鼠肝星狀細胞增殖的抑制作用，觀察其抑制HSC增殖的最佳濃度和最佳時間。本實驗結果顯示，在一定范圍內SS-d對HSC增殖具有一定的抑制作用，且隨著時間的延長，抑制效果明顯升高，2.5、5.0、10.0mg/L范圍內作用24h，可呈現出良好的量效和時效關系，提示抑制肝星狀細胞增殖是SS-d抗肝纖維化作用的機制之一。

[1]李素婷，齊潔敏，楊鶴梅，等.柴胡皂苷-d對酒精性肝纖維化大鼠星狀細胞活化的影響[J].遼寧中醫雜志，2007,34(10):1492-1493.

[2]張春燕.肝星性細胞的活化對肝纖維化形成的影響[J].當代醫學，2007，131(12):170-172.

[3]韋燕飛，彭岳，謝海源，等.基于肝星狀細胞分子機制的抗肝纖維化研究進展[J].世界華人消化雜志，2009,17(17):1745-1748.

[4]陳爽，賁長恩，楊美娟，等.柴胡皂甙對肝細胞增殖及基質合成的實驗研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，1999,5(5):21-25.

[5]祖寧，董晞，付桂香，等.柴胡皂苷d 對體外培養的大鼠腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質分泌的影響[J].中國中西醫結合雜志,2007，27(4):321-324.