色素上皮衍生因子在DM時腎臟病變中的作用及意義

蘇哲君，馬 莉，陳志宏

(1.承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000;2.承德醫學院)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的嚴重微血管并發癥，是導致慢性腎功能不全的重要原因之一[1]。目前，DN的發病機制尚未完全明了，有研究認為，高血糖或血脂代謝紊亂作為啟動因素，誘導各種血管活性物質、生長因子、細胞介質和蛋白質等，多種因素綜合作用導致了DN的發生、發展，最終由于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度積聚引發腎小球硬化和腎間質纖維化，治療十分困難[2]。因此，深入探討DN的發生機制具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 清潔級雄性SD大鼠24只(河北醫科大學實驗動物學部，合格證號:712024)，隨機分為正常對照組和糖尿病模型組，每組12只。正常對照組:大鼠常規飼養，不做任何處理;糖尿病模型組:小劑量(25mg/kg)鏈脲佐菌素(2%)連續腹腔注射(3d)建立糖尿病大鼠模型，7d后以空腹血糖≥16.7mmol/L作為成模標準[3]，待模型成功建立后，大鼠不再做任何處理。

1.2 檢測血糖 各組大鼠禁食12h后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經內眥于眶后靜脈叢采血，3000r/min離心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測各組大鼠的血糖。

1.3 檢測腎臟色素上皮衍生因子的表達 大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。采用Western Blotting法檢測腎臟色素上皮衍生因子(pigment epthelium-derivedfactor，PEDF)蛋白的表達:取200mg腎臟，提取蛋白后用BCA蛋白定量試劑盒(北京泰格美科技有限公司)定量蛋白濃度，蛋白上樣量60μg;12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜，兔抗PEDF抗體(武漢博士德生物技術有限公司)稀釋濃度1:200，4℃孵育過夜;Super ECL Plus超敏發光液顯影。采用Quantiy One軟件對顯影條帶進行定量分析，以PEDF條帶與β-actin條帶的比值作為PEDF蛋白的相對表達水平。

1.4 統計分析 采用SPSS 15.0軟件行t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠的血糖 與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠的血糖明顯升高(P＜0.01)。見附表。

2.2 各組大鼠腎臟PEDF的表達 在蛋白Marker的50KD水平處，可見PEDF蛋白條帶;在蛋白Marker的43KD水平處，可見β-actin條帶。與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠腎臟PEDF蛋白的表達明顯降低(P＜0.01)。見附表。

附表 各組大鼠血糖和腎臟PEDF的表達(±s)

附表 各組大鼠血糖和腎臟PEDF的表達(±s)

組別 n 血糖(mmol/L)腎臟PEDF的表達正常對照組 12 10.83±2.03 0.401±0.050糖尿病模型組 12 29.45±4.82* 0.339±0.014 P ＜0.01 ＜0.01

3 討論

PEDF是絲氨酸蛋白酶抑制劑基因家族成員，在全身許多組織器官都有表達，在腎臟主要分布于腎小管上皮細胞和間質[4]。PEDF可通過抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)誘導的血管內皮細胞的增殖與遷移，降低腎小球毛細血管的通透性，從而減輕蛋白尿。目前，PEDF抑制新生血管生成的機制尚不十分明確[5-6]。有研究發現，隨PEDF劑量的增加，培養液中凋亡內皮細胞的數量逐漸增加，因此推測，PEDF可能具有促進內皮細胞凋亡的作用。另外，研究發現，PEDF還有可能使血管內皮細胞對缺血、缺氧誘發的新生血管形成的信號無反應，從而進一步抑制新生血管形成[7]。本研究發現，DM模型大鼠腎臟PEDF蛋白的表達明顯低于正常對照組大鼠。一方面，PEDF表達水平降低，對VEGF的抑制作用減弱，使腎小球毛細血管的通透性增加;另一方面，PEDF水平降低使其促進內皮細胞凋亡的作用減弱，因而促進腎臟新生血管形成。因此，本研究推測，DM時腎臟PEDF表達下降，是DN發生發展的重要參與因素。

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