糖預處理對重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠胰島素敏感性的影響及其機制

朱烈烈，戴慧芳，李永領，陳大慶

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325027）

應激性胰島素抵抗（insulin resistance，IR）現(xiàn)象在各種類型創(chuàng)傷應激中均普遍存在。目前機制尚未完全清楚。已有研究提示術后早期的IR與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter-4，GLUT4）的轉(zhuǎn)位功能障礙關系密切[1]。但GLUT4介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運體系的效能除了與GLUT4的轉(zhuǎn)位有關外，還與GLUT4的基因表達有關[2]。目前有關應激所致IR與GLUT4基因表達的關系，所知甚少。另外，糖預處理作為一種十分簡捷有效的策略，已經(jīng)在腹部外科及髖關節(jié)置換術等外科實踐中證實其在減輕術后應激性IR程度方面的價值[3]，但具體作用位點存在爭議[4-5]。本研究采用改進型Feeney自由落體創(chuàng)傷性腦損傷模型[6]，通過RT-PCR法測定大鼠外周組織（骨骼肌和皮下脂肪）GLUT4 mRNA的表達來探討顱腦創(chuàng)傷后IR發(fā)生的機制以及糖預處理策略對其的影響。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑 胰島素檢測試劑盒（放射免疫法，天津德普公司）、一步法總RNA提取劑（Trizol Reagent，Invitrogen，USA）、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（Promega，USA）、Random-6-Primer（Takara，Japan）、GLUT4及β-actin上下游引物（3OD，北京奧科公司）

1.2 實驗動物分組及模型制備 健康成年雄性同窩別Wistar大鼠36只, 體質(zhì)量300～350 g，平均322 g。購自湖北省實驗動物研究中心[動物合格證號：SCXK（鄂）2011-0005]。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心清潔級。 隨機分為對照組、創(chuàng)傷性腦損傷組和糖預處理組，每組各12只。各組均在實驗前禁食水12 h，采用自制改進型Feeney自由落體創(chuàng)傷性腦損傷裝置，用40 g砝碼從25 cm高處墜落致重型腦創(chuàng)傷，對照組不致傷。糖預處理組在致傷前3 h通過胃管灌入糖負荷10%葡萄糖溶液30 mL，其余處理同創(chuàng)傷性腦損傷組。

1.3 血糖和血清胰島素測定 分別在傷前1/2 h、傷后3 h、24 h、72 h和7 d測定各組血糖和血清胰島素。每次取鼠尾血1滴用OneTouch微型血糖儀測血糖，另取血1.0 mL用于血清胰島素測定。將結(jié)果進行公式法[7]評定IR的程度：胰島素敏感性（IAI）指數(shù)（FPG：血糖濃度；FINS：胰島素濃度）計算各時點的IAI。

1.4 骨骼肌和皮下脂肪組織樣本制備 三組均于上述相應采血時刻取大鼠股四頭肌部位骨骼肌和皮下脂肪樣本約0.1～0.2 g，立刻放入液氮中冷凍，30 min后置于-80 ℃凍存。待RT-PCR檢測樣本GLUT4 mRNA含量。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間比較應用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖變化 與對照組比，創(chuàng)傷性腦損傷組在傷后3 h血糖即已升高（P＜0.05），至傷后24 h達到峰值（P＜0.01），隨后逐漸下降，直到傷后7 d尚未恢復至傷前水平（P＜0.05）。糖預處理組則在傷前1/2 h即出現(xiàn)血糖升高（P＜0.05），其余同創(chuàng)傷性腦損傷組。見表1。

表1 各組大鼠血糖變化（n=12，±s，mmol/L）

表1 各組大鼠血糖變化（n=12，±s，mmol/L）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別對照組創(chuàng)傷性腦損傷組糖預處理組傷前1/2h 2.53±0.21a 2.45±0.39a 3.31±0.25a傷后3h 2.44±0.36a 4.31±0.40a 4.40±0.71a傷后24h 2.28±0.29b 6.55±0.76b 6.32±0.91b傷后72h 2.61±0.56a 4.52±0.68a 4.05±1.98a傷后7d 2.65±0.27a 3.72±0.86a 3.65±0.18a

2.2 血清胰島素變化 與對照組比，創(chuàng)傷性腦損傷組在傷后3 h血清胰島素即已升高（P＜0.01），到傷后24 h達到峰值（P＜0.01），隨后逐漸下降，直到傷后72 h恢復到對照組水平。糖預處理組則在傷前1/2 h即出現(xiàn)胰島素升高（P＜0.05），其余同創(chuàng)傷性腦損傷組。見表2。

表2 各組大鼠血清胰島素變化（n=12，±s，mU/L）

表2 各組大鼠血清胰島素變化（n=12，±s，mU/L）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別對照組創(chuàng)傷性腦損傷組糖預處理組傷前1/2h 12.43±2.30a 11.38±3.01a 18.01±4.05a傷后3h 14.03±2.91b 25.22±4.42b 22.49±6.19b傷后24h 14.48±3.38b 28.95±3.86b 26.01±0.91b傷后72h 14.81±2.09 15.90±2.64 14.24±3.99傷后7d 13.47±3.18 12.72±4.76 13.97±5.45

2.3 IAI變化 與血糖和胰島素變化趨勢一致，與對照組比，創(chuàng)傷性腦損傷組IAI在傷后3 h即已下降（P＜0.05），到傷后24 h達到谷值（P＜0.01），隨后逐漸回升，直到傷后7 d恢復至對照組水平。糖預處理組則在傷前1/2 h即出現(xiàn)IAI下降（P＜0.05），同樣在傷后24 h達到谷值，但與創(chuàng)傷性腦損傷組比較，傷后24 h糖預處理組IAI下降較少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠胰島素敏感性變化（n=12±s）

表3 各組大鼠胰島素敏感性變化（n=12±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與創(chuàng)傷性腦損傷組比：cP＜0.05

組別對照組創(chuàng)傷性腦損傷組糖預處理組傷前1/2h-3.66±0.21-3.30±0.19-5.00±0.23傷后3h-3.82±0.29a-5.19±0.67a-5.32±1.01a傷后24h-3.50±0.46cc-6.16±0.96bc-5.83±0.26ac傷后72h-3.48±0.43a-4.21±0.55a-3.51±0.41a傷后7d-3.25±0.77-3.92±0.44-3.32±1.23

2.4 骨骼肌和脂肪組織中GLUT4 mRNA的表達量 同對照組類似，創(chuàng)傷性腦損傷組骨骼肌樣本GLUT4 mRNA表達量在各個采集點差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但與對照組比，在脂肪組織樣本上，傷后24 h、72 h時刻均出現(xiàn)了脂肪細胞GLUT4 mRNA的表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。糖預處理組情況類似，但與創(chuàng)傷性腦損傷組比，脂肪組織傷后24 h時刻GLUT4 mRNA表達下降較少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組大鼠骨骼肌和皮下脂肪樣本GLUT4 mRNA的相對表達量（n=12±s）

表4 兩組大鼠骨骼肌和皮下脂肪樣本GLUT4 mRNA的相對表達量（n=12±s）

注：GLUT4 mRNA表達量以GLUT4與β-actin的光密度比值反映；與對照組比：aP＜0.01；與創(chuàng)傷性腦損傷組比：bP＜0.05

組別對照組 骨骼肌皮下脂肪創(chuàng)傷性腦損傷組 骨骼肌皮下脂肪糖預處理組 骨骼肌皮下脂肪傷前1/2h 1.0273±0.2051 0.6266±0.2132 0.9663±0.2207 0.7389±0.1974 1.0692±0.2679 0.6904±0.1681傷后3h 0.9905±0.1939 0.6077±0.1834 0.9629±0.1709 0.6389±0.1268 0.9496±0.1857 0.6011±0.0997傷后24h 0.9546±0.0783aa 0.5704±0.0783ab 0.8632±0.0955ab 0.2377±0.0863ab 0.9008±0.0798ab 0.3603±0.0938ab傷后72h 0.8909±0.1225a 0.5747±0.1506a 0.9509±0.1160 0.2500±0.1743a 1.0072±0.1403a 0.2408±0.1431a傷后7d 0.9932±0.1508 0.6679±0.1551 0.9061±0.2096 0.5443±0.2800 0.1063±0.2001 0.6403±0.1897

3 討論

創(chuàng)傷后IR作為一種特殊的IAI下降現(xiàn)象，是指由于創(chuàng)傷應激，產(chǎn)生一系列神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)的變化，引起機體對IAI暫時性下降，從而引起相應物質(zhì)代謝和生理機能的紊亂[8]。目前對應激性IR產(chǎn)生的機制和作用位點缺乏深入全面的了解。

本研究結(jié)果顯示，IAI在創(chuàng)傷后3 h即出現(xiàn)下降，與對照組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在傷后24 h達到谷值，且能持續(xù)較長時間（7 d）。這提示重型顱腦創(chuàng)傷大鼠模型上存在胰島素敏感性的暫時性下降即胰島素抵抗的現(xiàn)象。這與人類擇期手術上的研究結(jié)果一致，差異在于胰島素抵抗的達峰和持續(xù)時間等方面，考慮與種屬及應激強度的不同有關[8]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，作為臨床上曾用作控制術后應激性高血糖反應的措施之一的糖預處理，在本模型上能使出現(xiàn)胰島素抵抗的時間（傷前1/2 h）提前，同時使胰島素抵抗的程度下降。這驗證了糖預處理具有減輕胰島素抵抗的作用。

本研究還進一步探討了創(chuàng)傷后胰島素抵抗的機制及糖預處理效應的作用位點。借鑒糖尿病相關研究[9-10]，本研究選取外周組織（骨骼肌和皮下脂肪）的GLUT4轉(zhuǎn)錄層面為切入點和研究對象，發(fā)現(xiàn)大鼠骨骼肌樣本的GLUT4 mRNA的表達量在整個實驗過程中均無變化，而脂肪組織樣本則在傷后24 h和72 h采集點出現(xiàn)表達量的下降。結(jié)合胰島素敏感性的不同步變化（傷后3 h即出現(xiàn)下降），同時綜合考慮已知的外周胰島素刺激的葡萄糖攝取，80%以上由骨骼肌負責，脂肪組織的GLUT4介導的糖轉(zhuǎn)運只占很小的份額[2]，可以得出：在應對創(chuàng)傷應激時骨骼肌和脂肪組織在GLUT4轉(zhuǎn)錄水平上存在生物學行為的差異，但不管是對于脂肪組織還是骨骼肌組織，均難以用其GLUT4 mRNA的表達變化來解釋總體上重型創(chuàng)傷性腦損傷后胰島素抵抗的發(fā)生。

有關服糖的作用位點目前研究較少且有爭議。有人認為術前服糖主要影響術后葡萄糖的轉(zhuǎn)運和氧化代謝，而對糖的非氧化利用影響不大。但動物肌樣本的體外研究中并未發(fā)現(xiàn)糖預處理有影響糖轉(zhuǎn)運的效果，不過未排除服糖確實有促進糖氧化的作用[4-5]。本研究驗證了糖預處理減輕創(chuàng)傷后IR的效果，但這種效果并未在骨骼肌GLUT4 mRNA的表達量上獲得體現(xiàn)。盡管在脂肪組織相應時刻GLUT4 mRNA的表達上與糖預處理效應一致，但如上述，脂肪組織GLUT4介導的糖轉(zhuǎn)運只占20%不到的份額，該結(jié)果反映了服糖所致的減輕術后IR效應總體上與外周組織GLUT4轉(zhuǎn)錄活性之間的關聯(lián)性不高。因此，本研究基本可以認為：至少在重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型上，糖預處理減輕IR的作用位點不在GLUT4 mRNA水平。

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