RNA干擾血管平滑肌細胞高血壓相關基因FXYD5表達及其功能研究

施翔翔， 高瞻， 伍新雷， 黃周青， 楊德業，2

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 心內科，浙江 溫州 325000；2.杭州師范大學附屬醫院 心內科，浙江 杭州 310015）

原發性高血壓即高血壓病是老年人最常見的心血管疾病之一，近幾年國內外學者的研究結果表明：原發性高血壓是一種多基因疾病，可能存在多個“微效基因”的聯合缺陷[1-2]。FXYD蛋白家族最近被證明是一個組織特異性調節Na+-K+-ATPase的小跨膜蛋白家族[3]。我們之前的研究表明在阻力血管（腸系膜動脈第二、第三級分支）和腎臟組織FXYD5基因表達水平在13周齡的自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）組比Wistar大鼠（WKY）組下調14.8倍[4-5]，提示FXYD5可能在高血壓發病機制中扮演重要角色。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是近幾年才被認識的自然界進化保守而普遍存在的一種現象[6]，目前廣泛應用于哺乳動物細胞基因功能研究和基因表達調節。本實驗選擇RNAi技術特異性沉默其在血管平滑肌細胞內的表達，研究該高血壓相關基因的沉默對血管平滑肌細胞所造成的一系列影響，包括增殖能力、遷移能力及Na+-K+-ATPase的活性改變，為探索高血壓病新的致病基因及其發病機制提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM、0.05%胰酶/EDTA、胎牛血清購自Gibco公司；Trizol、Lipofectamine 2000轉染試劑、DEPC水均購自Invitrogen公司；RT試劑盒（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）購自立陶宛Fermantas公司；Power SYBR?Green PCR試劑盒購自ABI公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；超微量Na+-K+-ATPase測試盒購自南京建成生物工程研究所；Triton X 100溶液購自美國Amresco公司。

1.2 細胞培養 大鼠胸主動脈平滑肌細胞株（rat thoracic aorta smooth muscle cells A7r5，CRL-1444），購自美國標準生物品收藏中心（ATCC）。接種于含有10% FBS的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，定期觀察細胞生長情況，平均每3 d進行胰酶消化法傳代。

1.3 實驗方法

1.3.1 設計合成FXYD5特異的siRNA片段：siRNA片段由上海吉瑪公司合成，分別命名為siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。siRNA-con與大鼠基因組各基因均無明顯同源性。各序列分別為：siRNA-1正義鏈5’-GAGUUCUGUGACUACUCAUTT-3’，反義鏈5’-AUGAGUAGUCACAGAACUCTG-3’；siRNA-2正義鏈5’-CG AAAUGGCCACUGCGAAUTT-3’，反義鏈5’-AUUCGCAGUGGC CAUUUCGTT-3’；siRNA-3正義鏈5’-ACUUACAAGCAGCGA GAAATT-3’，反義鏈5’-UUUCUCGCUGCUUGUAAGUTT-3’；siRNA-4正義鏈5’-GGAAUUAUCAUCCUCACUATT-3’，反義鏈5’-UAGUGAGGAUGAUAAUUCCAG-3’；siRNA-con正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈5’-AC GUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.3.2 轉染及篩選高效干擾的siRNA片段：用FAMNC siRNA/Lipofectamine 2000（2.5μL/2.5μL）轉染CRL-1444細胞，培養48 h后激光共聚焦顯微鏡下觀察每孔細胞，獲得滿意轉染效率后，轉染各siRNA片段，48 h后各組以Trizol、RT試劑盒按說明書操作逆轉錄成cDNA，行PCR擴增。以GAPDH為內參照。設計并合成擴增引物：FXYD5上游引物（5’to 3’）gggtggtattgtcgtagtagaagg，下游引物（5’to 3’）atgtcaccgcccagtcag，產物長度：423 bp；GAPDH上游引物（5’to 3’）CATGGTCTACATGTCCAGT，下游引物（5’to 3’）GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC，產物長度：346 bp；α1亞單位上游引物（5’to 3’）TGCCTTCCCCTACTCCCTTCTCATC，下游引物（5’to 3’）CTTCCCCGCTGTCGTCCCCGTCCAC，產物長度：323 bp。產物經凝膠電泳，在Biorad凝膠成像系統成像，觀察目的條帶。

1.3.3 熒光實時定量PCR技術檢測干擾后FXYD5 mRNA表達水平：于NCBI網站查找大鼠FXYD5及GAPDH的基因序列，通過Primer Express 3.0軟件設計引物序列，由上海基康生物技術有限公司合成引物。FXYD5正向引物5’-CCTAGTGAAGGGCAGACACCAG-3’，反向引物5’-TGGCCATTTCGGTCAGTTG-3’；GAPDH正向引物5’-GTCATCATCTCCGCCCCTT-3’，反向引物5’-TTCTGAGTGGCAGTGATGGC-3’。以15μL反應體系進行實時定量PCR，包括：1μL cDNA，7.5μL 2×Power SYBR?Green PCR Mix，0.5μL前向引物，0.5μL后向引物。實時定量PCR條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循環。所有樣品設3個復孔，擴增完畢后，進行熔解曲線分析，判斷擴增產物單一性。通過比較ΔCt的方法進行基因表達的定量分析[7]。以GAPDH為內參，FXYD5在實驗組和空白對照組的mRNA表達水平的比值=2-（ΔCt實驗組-ΔCt空白對照組），ΔCt=CtmRNA-CtGAPDH。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞增殖：常規消化對數生長期的血管平滑肌細胞，顯微鏡下計數，以5000個細胞/孔接種到96孔板，24 h后分別轉染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-con對照組、空白對照組4組；37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續培養48 h后，將CCK-8與無血清DMEM以1:9混合，各孔加入100μL混合液，每組設3個復孔，邊緣孔用DMEM填充避免邊緣效應；繼續37 ℃、5% CO2的培養箱中培養1 h，酶標儀470 nm波長處檢測各孔光密度值并記錄，參比波長650 nm。

1.3.5 劃痕法檢測細胞遷移力：常規消化對數生長期的血管平滑肌細胞，接種6孔板轉染各組并繼續培養48 h后；每孔加入2 mL無血清DMEM同步化24 h；用無菌1000μL槍頭（直徑約1 mm）在各孔細胞生長單層的相同位置劃平行直線，造成“傷口”；加入含5% FBS的DMEM培養液2 mL，繼續培養24 h；4%甲醛固定20 min及1% Triton X-100作用5 min；蘇木精染色5 min后顯微鏡下觀察，隨機選取3個視野拍攝（×40），軟件（Image-Pro Plus，v6.0）測量遷移距離最遠的細胞到起始處的距離，計算均值。

1.3.6 血管平滑肌細胞膜Na+-K+-ATPase活性檢測：嚴格按照南京建成超微量Na+-K+-ATPase測定試劑盒說明書進行，Na+-K+-ATPase可分解ATP生成ADP及無機磷，根據測定無機磷的量可判斷ATP酶活力的高低。可見分光光度計636 nm處測吸光度值。規定每小時每毫克細胞蛋白中ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位。公式：ATPase活力（U/mgprot）=（測定管OD值-對照管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×標準管濃度×6*×7.8**÷勻漿蛋白含量（mgprot/mL），其中6*：定義上為每小時，實際操作為10 min酶促反應；7.8**：反應體系中為7.8倍稀釋。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。實驗數據經過方差齊性檢驗，以±s表示，多組間均數比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染及篩選高效干擾的siRNA片段結果 激光共聚焦顯微鏡下觀察每孔細胞，以綠色熒光細胞數與自然光下細胞總數的比值估算轉染效率，轉染效率在80%以上（見圖1）。RT-PCR初篩RNAi效率（見圖2）：目的條帶位于400～500 bp左右與引物設計時的PCR產物片段大小符合，篩選出siRNA-1和siRNA-2兩實驗組做隨后實驗。

圖1 CRL-1444轉染攜帶FAM基團的siRNA 48 h后通過激光共聚焦顯微鏡檢測。綠色熒光代表成功轉染的平滑肌細胞，轉染率約為80%

圖2 RT-PCR產物凝膠電泳圖

2.2 特異性干擾后FXYD5 mRNA表達水平 熔解曲線分析顯示FXYD5和GAPDH的PCR產物特異性高，無雜帶（見圖3）。FXYD5和GAPDH的擴增曲線見圖4，橫坐標為Ct值，縱坐標為ΔRn，Rn表示第n個循環時的熒光值，紅線為熒光閾值。轉染siRNA-1、siRNA-2和siRNA-con對照組與空白對照組的相對比值分別為0.133±0.116、0.098±0.072和1.003±0.262。siRNA-1使FXYD5的mRNA表達與空白對照組相比下降86.71%，差異有統計學意義（P＜0.01）；siRNA-2使FXYD5的mRNA表達與空白對照組相比下降90.17%，差異有統計學意義（P＜0.01）；siRNA-con對照組與空白對照組FXYD5的mRNA表達差異無統計學意義（P=0.996）。

圖3 熒光實時定量PCR引物熔解曲線

圖4 熒光實時定量PCR擴增曲線

2.3 特異性干擾FXYD5對平滑肌細胞增殖的影響轉染siRNA-1、siRNA-2和siRNA-con對照組的吸光光度值分別為1.040±0.141、1.097±0.206和1.062±0.111，與空白對照組的1.184±0.152比較差異無統計學意義（均P＞0.05），見表1。特異性干擾沉默FXYD5對平滑肌細胞的增殖無影響。

2.4 沉默FXYD5對平滑肌細胞遷移能力的影響 轉染siRNA-1、siRNA-2的平滑肌細胞遷移距離（μm）分別為188.098±9.900、180.247±25.497，較siRNA-con對照組的245.690±24.438和空白對照組的250.866±21.887顯著降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 轉染48 h后各組CRL-1444細胞的遷移情況（×40）

2.5 沉默FXYD5對平滑肌細胞膜Na+-K+-ATPase活性的影響 轉染siRNA-1、siRNA-2的Na+-K+-ATPase活性（U/mgprot）分別為2.894±0.170、2.944±0.060，較空白對照組的4.006±0.048顯著降低（P＜0.01），較siRNA-con對照組的3.587±0.064亦顯著降低（P＜0.05），見表2。

表1 轉染48 h后對各組CRL-1444細胞增殖能力的影響

表2 轉染48 h后對各組細胞膜Na+-K+-ATPase活性的影響

3 討論

RNAi現象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）引發的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后沉默的過程。RNAi具有特異、有效的基因沉默效應，克服了建立基因敲除動物模型費時費力的缺點，已成為基因功能分析和基因治療的重要手段。本實驗運用化學合成法，嚴格設計并合成了4個針對不同FXYD5基因mRNA序列區域的siRNA（siRNA-1～4）及采用公認的通用陰性對照來盡量避免脫靶效應，高效率地瞬時轉染大鼠血管平滑肌細胞，之后通過RT-PCR和熒光實時定量PCR驗證4個片段的抑制效率，發現siRNA-1和siRNA-2特異性地抑制了FXYD5基因mRNA水平的表達，抑制率分別達到86.71%和90.17%。以上結果說明我們在設計的4個siRNA片斷中成功篩選出2個能夠有效抑制FXYD5基因表達的siRNA序列，為今后構建siRNA表達載體，獲得FXYD5穩定低表達細胞株奠定了基礎。

FXYD蛋白家族是一類Na+-K+-ATPase的組織特異性調節因子。這些蛋白具有一個特征性的FXYD基序，兩個保守的甘氨酸殘基和一個絲氨酸殘基。FXYD5在結構上不同于其他的FXYD家族成員，它的胞外段氨基酸超過140個，明顯長于其他FXYD蛋白胞外端的40個氨基酸，并且它的胞內段只有15個氨基酸[8-9]。Lubarski等[10]的系列研究證明FXYD5和Na+-K+-ATPase之間存在相互作用，能明顯增加鈉泵的構型的轉變的效率，在爪蟾卵中FXYD5/FXYD4嵌合表達實驗證明它們與鈉泵的高親和力以及它的Vmax的增加都是通過FXYD5的跨膜區域介導的，其中已經證明的幾個相關氨基酸有Ala150、Ile160和Leu161。

本實驗室已研究表明：在阻力血管（腸系膜動脈第二、第三級分支）和腎臟組織FXYD5基因表達水平在13周齡的SHR組比WKY組下調14.8倍[5]，提示FXYD5可能是高血壓新的相關基因。我們進一步對相同周齡的WKY和SHR的腎組織和肺組織中的FXYD5的表達進行了對比研究，發現在4周、8周即處于高血壓前期的SHR和WKY的腎組織中FXYD5的表達沒有差異，而在13周即處于高血壓形成進展期的SHR的腎組織其表達明顯低于WKY[11]。對于FXYD5在高血壓的發生發展中扮演什么角色目前鮮有文獻報道。本實驗通過RNAi技術特異性沉默FXYD5在大鼠平滑肌細胞的表達，模擬了SHR大鼠體內低FXYD5表達的環境，發現FXYD5的低表達會導致細胞膜Na+-K+-ATPase活性明顯下降。而Na+-K+-ATPase作為真核細胞膜上的糖蛋白，介導細胞信號傳遞，對血管緊張性、心肌收縮、細胞增殖和死亡等產生重要影響[12]。已有研究證明高血壓病患者及SHR大鼠體內鈉泵活性降低[13]，且發現高血壓病患者子女的鈉泵活性也降低，提示高血壓病的高度遺傳傾向[14]。眾所周知，血管重塑既是高血壓發生的病理基礎，也是高血壓維持、進展的結構基礎。高血壓血管結構改變被證實與血管細胞的增殖、遷移有關[15]。高血壓血管重構主要表現為管壁增厚，血管壁/腔比例加大，血流阻力和血管反應性增加。中膜平滑肌細胞向內膜下遷移并增殖是包括高血壓、動脈粥樣硬化等在內的血管重構的重要發生機制之一。Hsieh等[16]報道在血清和血小板衍化生長因子等因子的趨化作用下，SHR中膜VSMC遷移快于WKY。這一現象不僅見于血壓已明顯升高的20周齡SHR，而且也見于高血壓前期的5周齡SHR，提示不僅血管平滑肌細胞增殖而且細胞遷移也可能參與高血壓血管重塑機制。本實驗的另一結果也發現抑制FXYD5的表達并不影響血管平滑肌細胞的增殖，但能使其遷移能力下降，即FXYD5表現出一種抗黏附的作用，提示FXYD5可能通過影響血管重塑在高血壓病進展期發揮一定的代償作用。

綜上所述，FXYD5在血管平滑肌細胞中的低表達能影響血管重塑，抑制鈉泵活性，從而在高血壓形成過程中扮演重要角色，可能是高血壓病新的相關基因之一，為進一步探索高血壓的發病機制及基因治療開辟了嶄新的途徑。

[1] 周雨生, 張衍文. 老年人單純收縮期高血壓的分離比與遺傳度調查[J]. 安徽醫科大學學報, 1997, 32(5): 542-544.

[2] Brown MJ. Science, medicine, and the future. Hypertension[J]. BMJ, 1997, 314(7089): 1258-1261.

[3] Crambert G, Geering K. FXYD proteins: new tissue-specific regulators of the ubiquitous Na+, K+-ATPase[J]. Sci STKE,2003, 2003(166): RE1.

[4] 陳長曦, 余祖善, 楊德業, 等. 大鼠自發性高血壓致病相關基因的初步篩選[J]. 溫州醫學院學報, 2006, 36(5): 430-433.

[5] 陳長曦, 楊德業, 余祖善, 等. 自發性高血壓大鼠FXYD5基因的實驗研究[J]. 中華高血壓雜志, 2007, 15(2): 119-123.

[6] Hannon GJ. RNA interference[J]. Nature, 2002, 418(6894):244-251.

[7] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C (T)) Method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.[8] Franzin CM, Yu J, Thai K, et al. Correlation of gene and protein structures in the FXYD family proteins[J]. J Mol Biol, 2005, 354(4): 743-750.

[9] Sweadner KJ, Rael E. The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression[J]. Genomics, 2000,68(1): 41-56.

[10] Lubarski I, Karlish SJ, Garty H. Structural and functional interactions between FXYD5 and the Na+-K+-ATPase[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 293(6): F1818-1826.

[11] 方飛, 李小旺, 施翔翔, 等. 自發性高血壓大鼠FXYD5基因表達的時空分布[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(3): 447-450.

[12]Liu L, Askari A. On the importance and mechanism of amplification of digitalis signal through Na+/K+-ATPase[J].Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2006, 52(8): 28-30.

[13]Spieker C, Zidek W, Rahn KH. Na+, K(+)-ATPase inhibition and intracellular electrolyte content in essential and secondary hypertension[J]. Am J Hypertens, 1991, 4(4 Pt 1):309-314.

[14]Mazzanti L, Rabini RA, Testa I, et al. Sodium metabolism in offspring of hypertensive parents[J]. Biochem Med Metab Biol, 1991, 45(2): 181-187.

[15]Kim S, Iwao H. Involvement of angiotensin II in cardiovascular and renal injury: effects of an AT1-receptor antagonist on gene expression and the cellular phenotype[J]. J Hypertens Suppl, 1997, 15(6): S3-7.

[16]Hsieh CC, Lau Y. Migration of vascular smooth muscle cells is enhanced in cultures derived from spontaneously hypertensive rat[J]. Pflugers Arch, 1998, 435(2): 286-292.