利用血清miRNAs表達譜分析荔枝核提取物降低db/db小鼠血糖的可能機制

張婷，郭景陽，喬敏敏，楊宇，陳琳，李春梅，呂建新

（溫州醫科大學 檢驗醫學院生命科學學院，浙江 溫州 325035）

2型糖尿病（T2DM）是由肝臟葡萄糖產生增加、葡萄糖利用異常及胰島素分泌不足引起的[1]，以胰島素抵抗和胰腺β細胞功能失調為特征的疾病[2]。糖尿病患者在世界范圍內正在迅猛增加，2000年全球糖尿病患者總數為1.71億，預計到2030年將達到3億以上，其中T2DM約占90%[3]。2004年統計顯示，我國糖尿病人數約4000萬，但是根據2009年最新公布的數據顯示，我國糖尿病患者已經達到9400萬[4]，說明實際糖尿病發病率增長將比預計高出很多。因此，目前迫切需要安全無不良反應，能防治糖尿病尤其是T2DM的藥物。

有研究顯示，從荔枝中提取的小分子多酚在體內和體外均可誘導一些改變，如抗腫瘤細胞凋亡[5]、對小鼠的抗氧化和抗感染作用[6]、對運動員的抗疲勞作用[7]。越來越多的研究[8-9]顯示，荔枝核提取物有調節血糖、改善糖尿病糖脂代謝紊亂和預防糖尿病并發癥發生的作用。但是對于荔枝核對T2DM降糖作用的分子機制我們目前還不清楚。microRNAs（miRNAs）是一種小的內源性非編碼RNA分子，這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，可以有效地降低靶mRNA的水平，在基因表達調控中起到重要的作用，當然，miRNA本身的表達也受到嚴格的調控。大量研究已經證實，miRNAs與胰島素抵抗的形成密切相關。因此，我們通過追蹤檢測T2DM的理想模型db/db小鼠的體質量、攝食量、飲水量、空腹血糖、糖耐量和胰島素耐量的變化，并通過血清miRNAs芯片和Real-time PCR技術，初步研究荔枝核降低db/db小鼠血糖的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 荔枝核提取物50 g，由南京中醫藥大學植物藥研究與新藥開發中心暨南京植物藥深加工工程研究中心提供；血糖儀和血糖試紙；胰島素；50%葡萄糖溶液；RNA提取試劑盒（QIAGEN）；大鼠胰島素ELISA試劑盒購自上海西塘生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連Takara公司；db/db小鼠由南京大學模式動物研究所提供，C57BL/6小鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方案：實驗于溫州醫科大學實驗動物中心完成。SPF級db/db小鼠8只和C57BL/6小鼠3只，雄性，鼠齡2個月左右，普通飲食，自由飲水。將小鼠分為3組：荔枝核處理組（db/db小鼠5只），未處理組（db/db小鼠3只）和正常對照組（C57BL/6小鼠3只）。分3籠飼養，編號并做好標記。荔枝核處理組用荔枝核提取物給予灌胃治療7周后給予去離子水灌胃3周，后繼續荔枝核灌胃2周，每只小鼠劑量為0.3 mL（含0.015 g荔枝核提取物溶于0.3 mL去離子水中），1次/d。未處理組和正常對照組一直給予等量去離子水灌胃。

1.2.2 體質量、攝食量、飲水量和空腹血糖檢測：體質量檢測：每周稱量小鼠體質量。攝食量檢測：灌胃3、6、9周時，每天上午9:00每籠小鼠給予50 g食物，第2天9:00稱量剩余的食物，繼續添加至50 g，連續5 d。飲水量檢測：灌胃3、6、9周時，每天9:00每籠小鼠給予200 mL去離子水，第2天9:00量取剩余的去離子水，繼續添加至200 mL，連續5 d。空腹血糖檢測：小鼠禁食整晚后，尾靜脈采血，檢測空腹血糖。

1.2.3 糖耐量和胰島素耐量試驗：糖耐量試驗：小鼠禁食整晚后，尾靜脈采血測定空腹血糖；之后腹腔注射50%葡萄糖（1 g/kg 體質量），于注射后30、60、90、120 min尾靜脈采血測定血糖。胰島素耐量試驗：小鼠禁食5 h后，尾靜脈采血測定空腹血糖；之后腹腔注射胰島素（1 U/kg體質量），于注射后30、60、90 min尾靜脈采血測定血糖。

1.2.4 血清Exiqon miRNAs芯片分析：血清miRNAs芯片檢測分析實驗流程：設計實驗基因芯片、制備RNA樣品（將荔枝核處理組和未處理組血清分別等量混勻后，取200μL血清提取總RNA）、標記miRNA、miRNA序列雜交、Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片，獲取掃描圖片后進行數據分析。芯片的具體實驗步驟，委托上海康成生物工程有限公司完成。

1.2.5 Sfmbt2表達水平：水合氯醛麻醉小鼠后，迅速分離肝臟和肌肉組織，用1% PBS清洗后保存在-80℃。提取肝臟和肌肉組織中總RNA，去除基因組DNA后逆轉錄成cDNA，通過Real-time PCR技術分析Sfmbt2表達水平的改變。用2-ΔΔCt來確定每個基因改變的倍數，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統計學處理方法 使用SPSS 17.0軟件進行統計分析。所有數據均用±s表示，兩組數據之間差異比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 荔枝核提取物對db/db小鼠和C57BL/6小鼠體質量、攝食量和飲水量的影響 荔枝核灌胃治療后，荔枝核處理組體質量與未處理組db/db小鼠差異無統計學意義（P＞0.05）；攝食量與未處理組小鼠相比無明顯改變（P＞0.05）；荔枝核處理組在灌胃6周時與未處理組相比，飲水量明顯減少（P＜0.05）。各組小鼠體質量、攝食量、飲水量見圖1。

圖1 各組小鼠體質量、攝食量、飲水量結果

2.2 荔枝核提取物對db/db小鼠和C57BL/6小鼠空腹血糖的影響 荔枝核灌胃治療后，db/db小鼠荔枝核處理組與未處理組相比，空腹血糖明顯下降（P＜0.05），與正常對照組比血糖差異無統計學意義（P＞0.05）。并且在灌胃8～10周時荔枝核處理組db/db小鼠給予去離子水灌胃，其空腹血糖比未處理組也明顯下降（P＜0.05）。db/db小鼠荔枝核處理組血糖維持在相對較低水平，未處理組血糖維持在較高水平，正常對照組C57BL/6小鼠血糖維持在正常水平。各組小鼠空腹血糖見圖2。

圖2 各組小鼠空腹血糖結果

2.3 荔枝核提取物對db/db小鼠和C57BL/6小鼠糖耐量和胰島素耐量的影響 結果顯示，荔枝核處理組db/db小鼠糖耐量受損無明顯改善（P＞0.05），正常對照組C57BL/6小鼠糖耐量在正常水平。各組小鼠糖耐量結果見圖3。

圖3 各組小鼠糖耐量結果

與糖耐量結果相一致，荔枝核處理組db/db小鼠與未處理組相比，胰島素耐量受損無明顯改善（P＞0.05），正常對照組C57BL/6小鼠胰島素耐量在正常水平。各組小鼠胰島素耐量結果見圖4。

2.4 db/db小鼠血清miRNAs基因結果分析 荔枝核灌胃治療后，血清miRNAs芯片結果顯示，db/db小鼠荔枝核處理組與未處理組相比，有120個miRNAs表達水平出現明顯改變，其中上調的基因有71個，下調的基因有49個。見圖5，下調的基因中mmumiR-297a-3p、mmu-miR-669f-5p、mmu-miR-467d-3p、mmu-miR-466c-5p均來源于Sfmbt2的第10內含子，見圖6。

圖4 各組小鼠胰島素耐量結果

圖5 各組小鼠血清miRNAs所示差異表達的miRNAs聚類圖

圖6 Sfmbt2內含子所包含的miRNAs

2.5 荔枝核提取物對db/db小鼠Sfmbt2表達水平的影響 通過Real-time PCR發現db/db小鼠荔枝核處理組肝臟組織中Sfmbt2表達水平降低，下降為未處理組的64.4%；肌肉組織中Sfmbt2表達水平與未處理組相比無明顯差異。見圖7。

圖7 db/db小鼠Sfmbt2表達水平

3 討論

糖尿病是威脅人類健康的主要疾病之一，病死率僅次于腫瘤和心血管疾病；且其在發達和發展中國家均以指數形式增加，年輕化趨勢明顯[10]。荔枝核提取物有調節血糖、改善糖尿病糖脂代謝紊亂和預防糖尿病并發癥發生的作用。db/db小鼠是一種由leptin基因受體缺陷引起的先天肥胖性T2DM模型[11]。db/db小鼠存在明顯的糖代謝異常，其糖尿病的表現和病程與人類T2DM極為相似，是研究T2DM的理想模型[12]。因此我們通過給予db/db小鼠荔枝核灌胃治療，初步分析荔枝核提取物降低db/db小鼠血糖的可能機制。

我們的研究結果顯示，荔枝核處理組db/db小鼠體質量、攝食量無明顯改變，飲水量在灌胃6周時明顯減少，說明荔枝核提取物灌胃治療可以改善db/db小鼠的飲水情況，但是對體質量和攝食量并無明顯改善，考慮可能是灌胃的時間不夠或灌胃劑量不夠。

荔枝核灌胃治療后，db/db小鼠荔枝核處理組空腹血糖水平明顯下降，而未處理組血糖一直處于較高水平；正常對照組C57BL/6小鼠前后血糖無明顯變化。說明荔枝核有一定的降糖效果，可明顯降低db/db小鼠的空腹血糖，與之前研究中顯示的荔枝核的降糖作用一致[8-9]。并且在灌胃8～10周時荔枝核處理組db/db小鼠給予去離子水灌胃，其空腹血糖比未處理組也明顯下降，說明荔枝核灌胃治療一段時間后，即使不再給予荔枝核，其血糖也可以維持在相對較低水平。

然而，荔枝核處理組db/db小鼠糖耐量和胰島素耐量受損情況并未出現明顯改善，我們猜測可能是因為模型小鼠胰島素抵抗比較嚴重，短期內不易改善。

miRNAs是一類新發現的內源性基因表達調節分子，研究顯示，它與胰腺中胰島素分泌功能[13]、脂代謝[14-15]、糖尿病并發癥如糖尿病心臟病[16-17]、糖尿病腎病[18]及其他多種疾病均密切相關，因此近年來miRNAs被考慮作為診斷疾病或監測病情進展的分子標志物。我們從血清miRNAs芯片表達譜中發現，db/db小鼠荔枝核處理組血清中miRNAs表達差異明顯，其中上調的基因有71個，下調的基因有49個，并且下調的基因中mmu-miR-297a-3p、mmu-miR-669f-5p、mmu-miR-467d-3p、mmu-miR-466c-5p均來源于Sfmbt2的第10內含子。之后我們通過Real-time PCR檢測結果發現，肝臟組織中Sfmbt2表達水平降低，肌肉組織中Sfmbt2表達水平無明顯差異，考慮血糖改變主要與肝臟代謝有關。db/db小鼠荔枝核灌胃治療后，其機制改變可能與Sfmbt2參與的機制有關，Sfmbt2基因是Polycomb group中的印記基因，它的早期胚胎遺傳父親的等位基因，晚期遺傳胚胎外組織[19-20]，然而對于荔枝核提取物降低db/db小鼠血糖的具體機制目前還不清楚，還需要進一步研究。

總之，本研究發現荔枝核可以明顯降低db/db小鼠的空腹血糖水平；并且，荔枝核灌胃治療后miRNAs及mRNA水平也發生改變。我們推測，荔枝核提取物對db/db小鼠的降糖作用可能與miRNAs及Sfmbt2表達變化有關，相關的機制還需要進一步研究。荔枝核是否可以作為一種新的口服降糖藥廣泛應用于T2DM患者，還有待于進一步的臨床驗證。

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