花生AhFAD2A基因啟動子的克隆與序列分析

摘要：利用染色體步移技術，從花生品種魯花14中克隆到716 bp的AhFAD2A基因啟動子片段。序列分析表明，該啟動子中含有多種種子特異性表達的元件，如GCN4基序、AGCCCA序列元件、Skn-1基序等，可能與AhFAD2A基因在種子中有較高的表達水平有關。啟動子中預測的調控元件的功能還需進一步實驗驗證。

關鍵詞：花生；AhFAD2A基因；啟動子；調控元件分析

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0030-04

花生是重要的油料作物和經濟作物，花生籽粒含油量約占種子干重的4427%～5386%[1]；而其儲藏油脂中80%左右為不飽和脂肪酸（其中油酸36%～67%，亞油酸15%～43%），飽和脂肪酸僅占20%左右（其中棕櫚酸6%～11%，硬脂酸2%～6%，花生酸5%～7%）[2～4]。花生籽粒油脂的品質是由脂肪酸的組成決定的，高油酸的花生穩定性好、營養價值高，對一些疾病有很好的預防作用。因此提高油酸的相對含量，增加油酸/亞油酸（O/L）的比值，已成為目前油料作物育種的重要內容，控制油酸向亞油酸轉化的微粒體△12脂肪酸脫氫酶（delta 12 fatty acid desaturase， Δ12FAD或FAD2）成為一個研究重點。

啟動子是基因的一個重要組成部分，控制基因轉錄水平的表達，對其功能的研究成為研究基因表達調控的重要內容。以往研究發現，在花生FAD2B基因編碼區上游存在一個16 kb左右的內含子[3，5]，而本實驗室前期的研究同樣發現花生FAD2A和FAD2B基因編碼區上游存在一個16 kb左右的內含子。但到目前為止對于花生AhFAD2基因內含子上游的啟動子的研究尚未見報道。本研究利用前期克隆到的花生內含子序列設計特異性的引物，采用染色體步移的方法克隆了AhFAD2A基因的啟動子，并利用數據庫對啟動子序列進行了分析，為下一步鑒定AhFAD2A啟動子的功能研究奠定基礎。

1材料與方法

11材料與試劑

花生品種：魯花14（LH14）由山東省花生研究所提供；大腸桿菌（Escherichia coil） DH5α、克隆載體pEASY-T3 Cloning Kit為北京全式金生物技術有限公司產品。

植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；GenomeWalker Universal Kit試劑盒為Clontech公司產品；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit購自北京全式金公司；內切酶DraⅠ、EcoR V、PvuⅡ、StuⅠ、EcoRⅠ為寶生物工程（大連）有限公司產品；氨芐青霉素為北京索萊寶科技有限公司產品；其他試劑均為進口或國產分析純。

12實驗方法

121花生基因組DNA的提取取花生LH14幼嫩的葉片02 g，用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，取DNA樣品用瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，用紫外分光光度計檢測樣品濃度。

122DNA文庫構建及啟動子片段擴增分別用內切酶DraⅠ、EcoR V、PvuⅡ、StuⅠ酶切LH14花生基因組DNA，而后在末端連接上人工接頭，構建獲得4個基因文庫LD、LE、LP和LS。

2結果與分析

21花生AhFAD2A基因啟動子的克隆

第一步PCR擴增的產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），4個不同模板反應體系的產物都有多條條帶，但并無特異性的條帶。因此對第一步的產物稀釋100倍作為第二步的模板（D/E/S/P）。第二步PCR擴增后用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現凝膠中有多條擴增較特異的條帶（圖2）。分別回收D、S擴增獲得的較小條帶，以及E與P中的全部條帶，對回收的條帶進行測序。序列分析發現，大部分序列都不符合要求，為非特異性擴增。只有以S為模板的產物序列與前期克隆到的堿基序列有300 bp重疊，序列大小為809 bp，去掉人工接頭36 bp序列，克隆到序列為773 bp。

22AhFAD2A啟動子序列預測分析

經過NCBI的BLAST比對后發現，克隆到的序列3′端與花生AhFAD2A基因組（GenBank： AF2487391） 序列的5′上游序列有70 bp的序列重合， 說明克隆到的773 bp序列是FAD2A的5′上游調控區序列。利用BDGP在線預測分析序列的轉錄起始位點為C，附近序列為AACAACTTAA（加粗的C為預測的轉錄起始位點）。因此克隆到的773 bp的序列有716 bp屬于AhFAD2A啟動子。

利用PlantCare和PLACE在線預測分析了AhFAD2A啟動子的序列，并推斷TATA框位于轉錄起始位點上游-32 bp處，離TATA框最近的CAAT盒則位于轉錄起始位點-260 bp處。

除了TATA框和CAAT盒，在克隆到的序列中還含有很多可以在種子中表達的啟動子元件：（1）AGCCA序列元件，位于克隆到序列的-20 bp處，保守的序列模式為A（G/C/A）CCCA，能夠提高種子貯藏蛋白的特異性表達[6]。（2）ACGT盒，位于-810 bp、-610 bp、-711 bp處，存在于多種植物種子貯藏蛋白基因啟動子序列中，是種子特異性表達所需的一種調控元件[7]。（3）GCN4基序（-410 bp），以TGTGTCA序列存在，是胚乳中特異性表達所需要的順式調控元件之一，大多數種子貯藏蛋白基因的啟動子中存在該功能元件[8]。（4）Skn-1基序，以GTCAT序列存在于-104 bp處，是植物種子胚乳特異性表達所需要的重要順式調控元件。（5）B盒是ACGTGG保守序列和G盒元件的復合體，是介導種子成熟階段不可缺少的ABA應答元件（ABA response element，ABRE）[9]。此外，-304 bp處-300ELEMENT元件與-248 bp、-27 bp的SEF元件也是發育種子中特異性表達所需要的功能元件[10，11]。

植物激素在種子的發育階段也起了很大的作用。種子發育早、中期的ABA水平控制著貯藏蛋白的積累，對于種子的發育有著很重要的作用。在克隆到的序列中含有很多的ABA應答元件。如：DPBF CORE（核心序列ACACNNGA）能與轉錄因子DPBF-1和DPBF-2結合，參與ABA的應答[12]；ABA響應元件ABRE，也是種子發育需要的重要功能元件[13]。CARE（CAACTC調控元件）調控GA誘導的水解酶的表達，是種子萌發必需的元件[14]。

綜合上述分析表明，AhFAD2A啟動子序列中有很多與種子蛋白表達相關的元件，這些元件在很多植物中被證明是種子蛋白積累所必需的，這與AhFAD2A在種子中有較強表達水平相一致。

除了上述元件外，AhFAD2A啟動子序列中還含有很多其他的應答元件，如光應答元件I-box（736 bp、-548 bp）、熱應答元件HSE（-306 bp、-403 bp）等等，它們都參與了不同組織、不同發育時期或不同生長條件下該基因的表達調控。3討論

近年來在擬南芥、大豆、芝麻等多種植物中獲得了FAD2基因序列。研究發現，不同物種FAD2基因組結構保守性很強，在不同植物5′上游調控區都含有1個靠近起始密碼子ATG的內含子[15]，這些內含子對基因的表達也起一定的調控作用。Kim等[15]研究發現芝麻FAD2基因內含子的792～1 516區可以促進該基因的表達。近年來許多研究發現，內含子具有調控基因表達水平或產生不同的時空表達模式的作用[15～19]，到目前為止已通過實驗驗證的基因表達增強型內含子至少包括40個不同的成員[20]。Jeon 等[16]研究發現，水稻α-tubulin基因OsTubA1第一個內含子包含有調控該基因在根尖、幼葉和幼嫩的花中表達的信息或元件，缺失后不能在這些組織中表達。AhFAD2A基因在其5′非編碼區也存在一個16 kb左右大小的內含子，該內含子是否也可以影響基因表達水平或時空表達模式還需要進一步的研究。

花生AhFAD2A基因在根、莖、葉、花和種子中均有表達，但在種子中表達水平較高。本研究獲得的FAD2A基因716 bp啟動子序列中含有很多與種子特異性表達相關的元件，這與AhFAD2A在種子中有較強表達水平相一致。但這些分析結果只是利用數據庫預測的，要確定這些元件是否真正具有預測的功能必需經過實驗的驗證。通過數據庫的預測可以提高實驗的目的性，為進一步通過實驗方法鑒定所含調控元件的功能提供重要參考。參考文獻：

[1]萬書波主編 花生品質學[M] 北京：中國農業科學技術出版社， 2005，2-10

[2]Moore K M， Knauft D A The inheritance of the high oleic acid in peanut[J] J Heredity， 1989， 80： 252-253

[3]Chu Y， Holbrook C C， Ozias-Akins P Two alleles of ahFAD2B control the the high oleic acid trait in cultivated peanut[J] Crop Sci， 2009， 49（6）： 2029-2036

[4]萬書波 中國花生栽培學[M]上海：上海科學技術出版社， 2003，1-10

[5]Lopez Y， Nadaf H L， Smith O D Genetic factors influencing high oleic acid content in spanish market-type peanut cultivars[J] Crop Sci， 2000， 41： 51-56

[6]Chen Z L， Schuler M A， Beachy R N Functional analysis of regulatory elements in a plant embryo-specific gene[J] Proc Natl Acad Sci USA， 1986， 83（22）： 8560-8564

[7]Vincentz M， Leite A， Neshich G， et al ACGT and vicilin core sequences in a promoter domain required for seed-specific expression of a 2S storage protein gene are recognized by the opaque-2 regulatory protein[J] Plant Molecular Biology， 1997， 34： 879-889

[8]Wu C， Washlda H， Onodera Y， et al Quantitative nature of the prolamin-box，ACGT and AACA motifs in a rice glutelin gene promoter： minimal cis-element requirements for endosperm-specific gene expression [J] Plant J，2000， 23：415-421

[9]Ezcurra I， Ellerstrom M， Wycllffe P， et al Interaction between composite elements in the napA promoter： both the B-box ABA-responsive complex and the RY/G complex are necessary for seed-specific expression[J] Plant Mol Biol，1999 ， 40（4）： 699-709

[10]Stalberg K， Ellerstrom M， Ezcurra I， et alDisruption of an overlapping E-box/ABRE motif abolished high transcription of the napA storage-protein promoter in transgenic Brassica napus seeds[J] Planta，1996，199： 515-519

[11]Lessard P A， Allen R D， Bernier F，et alMultiple nuclear factors interact with upstream sequences of differentially regulated beta-conglycinin genes[J] Plant Mol Biol，1991， 16（3）： 397-413

[12]Kim S Y， Chung H J， Thomas T LIsolation of a novel class of bZIP transcription factors that interact with ABA-responsive and embryo-specification elements in the Dc3 promoter using a modified yeast one-hybrid system[J] Plant J， 1997， 11（6）：1237-1251

[13]Thomas M S， Flavell R BIdentification of an enhancer element for the endosperm-specific expression of high molecular weight glutenin[J] Plant Cell，1990， 2（12）： 1171-1180

[14]Sutoh K， Yamauchi DTwo cis-acting elements necessary and sufficient for gibberellin-upregulated proteinase expression in rice seeds[J] Plant J，2003， 34（5）： 635-645

[15]Kim M J， Kim H， Shin J S， et al Seed-specific expression of sesame microsomal oleic acid desaturase is controlled by combinatorial properties between negative cis-regulatory elements in the SeFAD2 promoter and enhancers in the 5′-UTR intron[J] Mol Genet Genomics，2006， 276（4）： 351-368

[16]Jeon J S， Lee S， Jung K H， et al Tissue-preferential expression of a rice α-tubulin gene， OsTubA1， mediated by the first intron[J] Plant Physiol， 2000， 123（3）： 1005-1014

[17]Rose A B， Elfersi T， Parra G，et al Promoter-proximal introns in Arabidopsis thaliana are enriched in dispersed signal and evelate gene expression[J] The Plant Cell， 2008， 20： 543-551

[18]Jeong Y M， Mun J H， Lee I，et al Distinct roles of the first introns on the expression of Arabidopsis profilin gene family members[J] Plant Physiol， 2006， 140： 196-209

[19]Gianì S， Altana A， Campanoni P，et al In transgenic rice， alpha- and beta-tubulin regulatory sequences control GUS amount and distribution through intron mediated enhancement and intron dependent spatial expression[J] Transgenic Res，2009， 18（2）： 151-162

[20]Morello L， Gianì S， Troina F，et al Testing the IMEter on rice introns and other aspects of intron-mediated enhancement of gene expression[J] J Exp Bot，2011， 62（2）： 533-544