單子葉植物表達載體pUN3300的構建

摘要：植物雙元表達載體在植物基因工程研究中具有重要作用，表達載體所包含的結構元件，如啟動子、多克隆位點、篩選標記等，對植物遺傳轉化效率、外源基因表達強度及遺傳穩定性等具有重要影響。本研究中，為提高目的基因對單子葉植物的遺傳轉化效率，對植物表達載體pCAMBIA3300進行改造，在原有以bar基因作為選擇標記的基礎上，采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin啟動子，經酶切、測序表明，植物雙元表達載體pUN3300構建成功。該載體對于研究外源基因功能、植物性狀改良及新品種的培育，具有重要的價值。

關鍵詞：單子葉植物；表達載體；pUN3300；Ubiquitin啟動子；bar基因

中圖分類號：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0034-04

植物雙元表達載體是植物基因工程研究的重要組成部分。通過植物表達載體，外源目的基因可進入宿主細胞并高效表達，為闡明基因功能、利用基因資源改良作物種質奠定了基礎[1～3]。獲得穩定、高效的植物雙元表達載體是進行遺傳轉化研究的重要內容之一。目前，雖已有pBR121、pCAMBIA等系列的商業化表達載體出售，但并不能完全滿足實驗需求，因此，必須根據實際需要對表達載體進行改造。表達載體上攜帶的抗性標記基因是篩選轉化體的有效手段，但同時也帶來了生態環境及食品安全方面的潛在隱患，影響了大眾對轉基因植物的接受。而以除草劑抗性bar 基因作為篩選標記，具有一定的生物安全性，客觀上可消除人們的顧慮[4]。因此本研究中，選取以bar 基因為篩選標記的商業化表達載體pCAMBIA3300為基礎，通過不完全酶切等方法添加了單子葉植物高效、專一性啟動子Ubiquitin，構建并獲得了適于單子葉植物遺傳轉化的表達載體pUN3300，為外源目的基因對單子葉植物的遺傳轉化提供了有力的分子生物學工具。

1材料與方法

11試驗材料

植物表達載體pCAMBIA3300、含有Ubiquitin啟動子的植物表達載體pUN1301由本實驗室保存。大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金公司，各種限制性內切酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒、T4 DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司，其他各種試劑均為國產分析純產品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

12試驗方法

121Ubiquitin啟動子表達元件的獲得用HindⅢ單酶切植物表達載體pUN1301，電泳回收后用EcoRⅠ不完全酶切，產物經08%瓊脂糖凝膠電泳，回收產物2 240 bp，即為Ubiquitin啟動子表達元件。

122單子葉植物表達載體pUN3300的構建用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ雙酶切植物表達載體pCAMBIA3300，獲得長度為8 400 bp的產物，該回收產物與上步獲得的Ubiquitin啟動子表達元件混合后，經T4連接酶16℃連接過夜。熱激轉化大腸桿菌DH5α，將轉化產物涂布平板，在含有Kan （50 mg/L）的培養基上篩選，篩選到的陽性克隆經質粒提取，獲得載體pUN3300。

123單子葉植物表達載體pUN3300的鑒定利用DNAMAN軟件，分別在Ubiquitin啟動子、bar基因上設計PCR檢測引物UbiF：5′-CAAATCCACCCGTCGGCACCTC-3′；BarR：5′- CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3′，預期產物長2 350 bp。PCR檢測程序為：95℃變性30 s，64℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個循環。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后檢測特異條帶。將鑒定正確的菌液培養后提取質粒，經PstⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，構建正確的植物表達載體命名為pUN3300（圖1）。

2結果與分析

21Ubiquitin啟動子表達元件的獲得

pUN1301質粒由pCAMBIA1301在多克隆位點處克隆入一個Ubiquitin啟動子表達元件后得到。由于Ubiquitin啟動子內部約1 400 bp處含有EcoRⅠ酶切位點，為獲得完整的Ubiquitin啟動子表達元件，經HindⅢ單酶切后，其回收產物進一步用稀釋10倍的EcoRⅠ酶切3 min，進行不完全酶切。

電泳結果如圖2所示，兩條酶切條帶分別為2 017 bp和1 400 bp，其中2 017 bp是目的條帶，進一步將其切膠回收，獲得包含Ubiquitin啟動子和Nos末端的Ubiquitin啟動子表達元件。

22單子葉植物表達載體pUN3300的構建與檢測

將pCAMBIA3300載體酶切產物與Ubiquitin啟動子表達元件連接后轉化大腸桿菌，通過PCR與酶切鑒定質粒重組情況。利用在Ubiquitin啟動子和bar基因上設計的引物進行PCR鑒定，獲得大小為2 350 bp的條帶（圖3 ），與預期相符。將鑒定正確的菌液提取質粒，經酶切鑒定，分別獲得了1 800、1 600、600 bp三條帶（圖4），與預期大小相符。結果表明植物表達載體pUN3300構建成功。

3結論與討論

生物及環境安全是全球所共同關注的重大問題。pCAMBIA3300載體作為pCAMBIA系列商業化載體的一種，其以bar基因為篩選標記，無基因多效性。bar基因編碼產物膦絲菌素乙酰轉移酶（PAT）具有熱穩定性和消化穩定性，與已知毒素和過敏原均非同源。目前已證明其對人體和動物安全無毒， 同食物中的DNA一樣安全[5]。同時，草丁膦作為一種生物除草劑， 在土壤中易被快速分解， 對哺乳動物無毒、無害。因此，bar基因作為迄今應用最多的抗除草劑基因，也是唯一成功應用于農業生產上的選擇標記[6]，目前已成功地用于小麥、水稻、玉米、大麥、油菜等作物的遺傳轉化。

在植物基因工程研究中， 選擇高效專一的啟動子是外源目的基因能否在目標植物中進行高效表達的關鍵。pCAMBIA3300載體雖不含GUS 等報告基因，背景相對干凈，有利于后期轉基因產品的推廣和應用，但載體本身并不含有啟動外源基因表達的啟動子元件，鑒于本研究的轉化目標主要為水稻等單子葉植物，因此構建一個能夠使外源基因在單子葉植物中高效、穩定表達的植物表達載體尤為關鍵。本研究中所選用的玉米泛素Ubiquitin啟動子為組成型啟動子， 具有啟動效率高、甲基化程度相對較低、遺傳性狀穩定等優點，其在單子葉植物中活性極強，啟動的目的基因在單子葉植物中可持續、高效的表達。目前的研究表明，在水稻中，Ubiquitin啟動子誘導的GUS和bar基因的表達水平顯著高于35S啟動子，在水稻等單子葉植物分子育種中具有很大的應用潛力。因此，本研究選擇了Ubiquitin啟動子作為改造植物表達載體的首選啟動子[5]。

試驗中，由于Ubiquitin啟動子內部含有EcoRⅠ酶切位點，因此采用不完全酶切的方法加以分離。由于EcoRⅠ活性較強，試驗中為避免完全酶切，我們分別對不同的內切酶濃度進行了嘗試，最終確定將酶稀釋10倍加以應用并分別在酶切1、3、5、10 min后電泳檢測，發現在內切酶消化3 min時酶切效果較好。同時，酶切產物經08%瓊脂糖凝膠電泳，可使2 017 bp的不完全酶切條帶與1 400 bp的完全酶切條帶較好地分離，通過對上述條件的逐一優化，最終獲得了較理想的結果。目前，涉及不完全酶切的相關文獻較少，該方法的應用及相關試驗條件仍在不斷地摸索和優化中。

本研究獲得了以bar 基因為篩選標記，以專一性啟動子Ubiquitin為啟動元件的適于單子葉植物遺傳轉化的高效表達載體pUN3300，為進一步利用外源目的基因對單子葉植物進行遺傳轉化，獲得安全性較高的轉基因材料，進而改良作物種質資源提供了良好的分子生物學工具，具有廣闊的應用前景。參考文獻：

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