布氏乳桿菌PG—7去除膽固醇和抗氧化能力的研究

摘要：從糖蒜中篩選分離到的一株具有降膽固醇和抗氧化能力的產乳酸菌株PG-7，該菌對膽固醇的去除率為581%，對DPPH自由基和超氧自由基的清除率分別為917%和162%。克隆了PG-7的16S rDNA序列，并以其同源性為基礎構建了相關屬種的系統發育樹。結果表明，該菌16S rDNA序列全長1 638 bp，BLAST顯示該菌株與乳桿菌屬同源；PG-7菌株在進化關系上與布氏乳桿菌屬（Lactobacillus buchneri）聚成一族。將其鑒定為布氏乳桿菌屬，命名為：Lactobacillus buchneri PG-7。

關鍵詞：乳酸菌；膽固醇；抗氧化；系統發育分析

中圖分類號：Q939.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0100-04

傳統發酵食品已成為現代生活重要的健康食品。乳酸菌是發酵食品的最主要菌群，發酵食品的功能與乳酸菌密切相關。乳酸菌也是最重要的益生菌資源，國內外研究表明乳酸菌益生菌菌株具有抗氧化能力和去除膽固醇能力，乳酸菌等益生菌延緩衰老的機制主要是通過改善腸道微生態平衡、清除內自由基實現的[1～6]。張天博等（2007）[7]評價了52株乳酸菌的抗氧化能力，并對其中3株具有較強清除DPPH自由基能力的菌株進行了羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力研究，結果表明，同一菌株對不同種類自由基清除能力不同，乳酸菌的細胞和無細胞提取物對自由基的清除能力亦不同。張江巍等（2005）[8]進行了30株乳酸菌清除DPPH自由基和抗亞油酸過氧化能力的實驗，從中篩選出兩株抗氧化活性較強的乳酸菌株，并研究了其無細胞提取物對Fe2+螯合能力、超氧自由基和羥基自由基清除能力和菌株SOD活性。糖蒜作為我國傳統發酵食品，腌制期間的乳酸菌功能對糖蒜的風味和功能具有重要影響，但有關這方面的報道較少。本實驗研究了分離于市售糖蒜的一株產乳酸細菌的體外膽固醇去除能力及抗氧化能力，并進行了系統發育分析，為研究健康食品的作用機制提供了理論依據。

1材料與方法

11供試材料

菌株PG-2、PG-4、PG-7和PG-8從市售糖蒜分離得到，革蘭氏陽性，產乳酸，本實驗室保存。

12菌體及無細胞提取物的制備

保藏菌種經過傳代活化后，以質量分數為3%接種量接種于MRS液體培養基，37℃靜置培養18 h，3 000 r/min，離心15 min，收集菌體。離心后的菌體用pH值為74的磷酸緩沖溶液（PBS）洗滌3次，重新懸浮于磷酸緩沖溶液中，調整菌數至109 cfu/ml，用作菌體實驗用。將109 cfu/ml菌體液超聲波冰浴破碎，細胞殘骸于10 000 r/min離心10 min，上清液即為無細胞提取物。

13膽固醇去除測定

參照Brashears等（1998）[9]的方法，并略有改進。樣品預處理：取2 ml培養液，5 000 r/min離心7 min。取1 ml上清于離心管中，加入9 ml無水乙醇，振蕩處理5 min，10 000 r/min離心10 min。取2 ml上清加入2 ml P-Fe-S試劑，冰浴混勻反應30 min。測OD550。試驗菌種活化后接種于MRS培養基，37℃培養過夜，作為種子液。將種子液接種于含5%蛋黃液的MRS培養基中，每瓶取2 ml用來測定初始培養基中膽固醇含量，37℃培養24 h后再次測定培養基中膽固醇含量，計算膽固醇去除率。

14二苯代苦味酰基（DPPH）自由基測定

DPPH 溶于無水乙醇，反應時1 ml提取液加1 ml濃度為02 mmol/L的DPPH，室溫下靜置30 min后，在517 nm處測吸光度變化[7]。

DPPH·的清除率（%）=[1- （A1-A2）/A3]×100

式中：A1表示未加樣品的DPPH 溶液的原始吸光度；A2表示樣品在測定波長時的本身吸光度；A3表示加樣后DPPH溶液的吸光度。

15超氧陰離子自由基（O-·2）測定

反應體系包括濃度為150 mmol/L的Tris-HCl（pH82）、濃度為3 mmol/L的二乙三胺五乙酸、濃度為12 mmol/L鄰苯三酚和05 ml樣品，總反應體積為35 ml。25℃恒溫水浴反應10 min，測OD325[8]。

O-·2清除率（%）=〔1-（A11-A10）/（A01-A00）〕×100

式中： A00為不含樣品和鄰苯三酚；A01為不含樣品，含鄰苯三酚；A10為含樣品，不含鄰苯三酚；A11為含樣品和鄰苯三酚。

1616S rDNA基因的克隆、測序

菌株基因組DNA的提取參照《精編分子生物學指南》[10]的方法，略有改動。擴增細菌16S rDNA通用引物：上游P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游P2：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。以菌株基因組為模板，P1、P2為引物，PCR擴增16S rDNA。

PCR擴增條件為：95℃ 5 min；94℃ 40 s， 55℃ 40 s， 72℃ 2 min，30個循環；最后72℃ 10 min。PCR擴增產物凝膠回收后克隆至PMD19-T載體，轉化Ecoli DH5α，藍白斑篩選，挑白色菌落提取質粒進行酶切、PCR鑒定。正確的陽性克隆測序（北京博尚生物公司）。

17系統發育樹構建

將菌株16S rDNA序列在NCBI上與GenBank里的已知核酸序列進行Blast分析。對比同源性較高的已知菌株16S rDNA基因序列，ClustalX183[11]進行多序列比對，采用Neighbour-Joining[12]方法，通過Mega30軟件構建系統發育樹。重復取樣1 000次進行自展值（bootstrap value）分析，以評估系統進化樹拓撲結構的穩定性。

2結果與分析

21膽固醇的去除作用

人體內膽固醇的來源主要有兩種，一是內源合成，二是外源攝取。針對內源合成，一般通過篩選能夠抑制膽固醇合成限速酶HMG-CoA的物質來尋找降膽固醇的功能性物質。針對外源攝取，目前多是通過吸附吸收膽固醇來達到降膽固醇的目的。本研究的模型就是針對外源攝取而設計的。結果表明，不同株菌對膽固醇脫除作用差異較大，菌株PG-2、PG-4、PG-7和PG-8生長期間對培養基中膽固醇去除率分別為215%、923%、581%和198%，其中PG-7對膽固醇去除作用效果最好。

22抗氧化作用

DPPH·是一種很穩定的以氮為中心的自由基，若受試物能清除它，則表示受試物具有降低羥自由基、烷自由基或超氧自由基等自由基的有效濃度。超氧陰離子自由基（O-·2）是第一氧自由基，可以通過一系列反應生成其它氧自由基，具有重要的生物功能，并且與多種疾病密切相關。研究結果表明，4個菌株發酵液上清對DPPH·均具有很強的清除能力，PG-7菌株無細胞提取物清除DPPH·的能力最強，清除率為704%，其次是菌株PG-4，清除率為435%，菌株PG-2和PG-8的清除能力較低。菌株對O-·2的清除作用明顯低于DPPH·，而且發酵液上清的清除能力高于無細胞提取物，菌株PG-7的清除能力明顯高于其它菌株（表1）。本研究顯示，發酵液上清的清除能力明顯高于無細胞提取物，表明乳酸菌生長期間的代謝產物對清除自由基具有重要作用。

23 PG-7菌株16S rDNA序列的PCR擴增和測序

以提取菌株PG-7總DNA為模板，以細菌16S rDNA通用引物P1、P2為引物進行PCR擴增，得到約1 500 bp左右的特異性條帶，與預期相符（圖1）。

PCR產物回收純化后，連接PMD19-T載體，轉化Ecoli DH5α。提取轉化子質粒，進行EcoRⅠ 和HindⅢ雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，酶切得到兩條片段，分別為載體片段（約2 700 bp）和目的片段（約為1 500 bp）（圖2A），與預計相符。進一步以轉化子質粒為模板，P1、P2為引物進行PCR鑒定。電泳檢測顯示，PCR擴增出一條與目的基因一樣大小的特異性條帶，約為1 500 bp（圖2B）。結果表明，重組克隆質粒PMD19-16S構建成功。鑒定成功的陽性克隆，送往北京博尚生物公司進行序列測定。

24系統發育分析

PG-7菌株16S rDNA序列PCR擴增及測序結果表明，其16S rDNA基因全長1 638 bp。利用NCBI的BLAST進行在線比對，結果表明該菌屬于乳酸桿菌屬細菌。根據同源性比對結果，調出相關性最高的序列和乳酸桿菌菌屬內相關菌株的16S rDNA，利用ClustalX183進行多序列比對，采用Neighbour-Joining方法，通過Mega30軟件構建系統發育樹（圖3）。結果表明，PG-7菌與布氏乳桿菌聚在一群，其同源性均在98%～99%之間。將其鑒定為Lactobacillus buchneri PG-7。

3討論

乳酸菌去除膽固醇和抗氧化能力是其保健功能的重要指標。研究表明，從傳統發酵食品糖蒜中分離的乳酸菌體外去除膽固醇和抗氧化能力較強，菌株PG-7對培養基中膽固醇的清除率為581%，發酵液上清對DPPH·和O-·2的清除率分別為917%和162%，發酵液上清比無細胞提取物對自由基的清除能力更強。崔志文等（2011）[13]發現鼠李糖乳桿菌上清液具有較強的抗氧化能力。吳祖芳等（2010）[14]也曾報道菌懸液清除超氧陰離子自由基的能力高于無細胞提取物，并且通過對戊糖乳桿菌和植物乳桿菌的菌懸液及無細胞提取物抗氧化能力比較推測，乳酸菌的抗氧化能力與菌體表面的某些成分及細胞本身抗氧化機制有關。對PG-7的分子鑒定及系統發育分析表明，其屬于布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）。國內外有關于L buchneri 產細菌素[15]和青貯飼料發酵和需氧穩定性[16]等方面的研究，對于布氏乳桿菌去除膽固醇和抗氧化能力的報道較少。本研究對于傳統發酵食品的功能開發，特別是布氏乳桿菌益生保健功能研究具有重要價值。后續的工作將開展Lactobacillus buchneri PG-7的代謝及調控機制研究，為菌株功能開發提供理論依據。參考文獻：

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