花生赤霉素2—氧化酶基因的克隆和表達研究

摘要：赤霉素2-氧化酶（GA2ox）是赤霉素合成過程中起負調控作用的一種關鍵酶，催化有活性的赤霉素生成無活性的赤霉素。從花生莢果發育不同時期的轉錄組序列中篩選到GA2ox的基因片段，采用5′-RACE方法克隆了花生GA2ox基因的全長cDNA序列。序列分析表明，花生GA2ox蛋白氨基酸序列含有和其他植物同樣保守的結構域。通過qRT-PCR技術對GA2ox基因在花生不同組織器官中的表達分析，發現所檢測的10種組織中均有GA2ox的表達，其中成年葉片中表達最豐富，根、剛入土的果針次之。本研究結果為進一步分析該基因在花生生長發育過程中的作用提供了有用信息。

關鍵詞：花生；赤霉素；赤霉素2-氧化酶；基因表達

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0014-05

赤霉素（gibberellins， GAs）是一類四環雙萜類的植物激素，具有生物活性的赤霉素在高等植物種子萌發、莖伸長、開花誘導及種子和果實的生長等過程中起著重要作用。植物也可以通過調節內源赤霉素的生物合成介導自身對環境因子的應答[1，2]。自1935年首次成功分離出赤霉素以來，已經發現一百多種赤霉素分子，但僅有GA1，GA3和GA4等少數具有生物學活性[3，4]。

多種酶參與植物體內赤霉素的生物合成，GA2-氧化酶（gibberellin 2-oxidase， GA2ox）是在赤霉素合成途徑中起負調控作用的一種關鍵酶，GA2ox作用于有生物活性的GA1和GA4，使兩者在C-2位羥基化轉變成無活性的GA8和GA34[5]。在植物中豌豆的GA2ox （SLN）最早被克隆，其編碼蛋白能催化GA1、GA4和GA20生產相應的2β羥基化產物，它一般在花、根和種皮中表達[6，7]。目前，多種高等植物的GA2ox基因已經被克隆和研究，結果表明GA2ox基因一般以基因家族的形式出現。GA2ox家族可以分為3類，第一類和第二類作用于C19-GAs（GA1和GA4），使之失活，或使其前體（GA9和GA20）失活；第三類作用于C20-GAs，使之2β-羥基化，這類基因包括（AtGA2ox7-8和SoGA2ox3）。后來的研究發現菠菜的GA2ox1可以同時作用于C19-GAs和C20-GAs[9]。這些研究結果表明植物中存在兩種具有不同特異性的GA2-氧化酶。

GA2ox催化GAs進行羥基化反應使植物體內GA含量降低。在煙草中過量表達AtGA2ox7-8會使赤霉素含量降低，產生矮化表型[8]。在擬南芥中過量表達GA2ox可以使植株出現矮化，而且使開花時間延長，影響種子的育性等[10～12]。本研究通過轉錄組測序和RACE技術首次從花生中克隆得到AhGA2ox基因，并對該基因進行生物信息學分析，對該基因在花生不同組織器官中的表達進行研究，為今后研究花生莢果發育過程中赤霉素合成調控以及赤霉素信號傳導的作用奠定了基礎。

1材料與方法

11試驗材料

以魯花14花生品種為材料，大田栽種，日常管理，收集不同發育時期的根、莖、葉、花、果針、莢果和種子，用于RNA提取。

12試驗方法

121cDNA 合成與高通量測序提取不同發育時期花生莢果的總RNA，用Agilent 2100檢測提取RNA樣品的質量與純度，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。將來自于入土生長0、3、10天的花生果針mRNA等量混合，加入破碎緩沖液將mRNA打斷成短片段（ 200～700 nt ），以mRNA為模板，用隨機引物合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H（Invitrogen）和DNA 聚合酶 Ⅰ（New England Biolabs）合成cDNA第二鏈，經純化后做末端修復，加poly（A）并連接測序接頭，用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，進行PCR擴增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM 2000進行測序。

122數據分析得到測序結果后，將原始數據去除接頭得到clean reads，用SOAPdenovo軟件將clean reads進行無參考基因組拼接，最終得到unigenes。對得到的unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG 等數據庫進行BlastX （E value <10-5）比對分析，并根據注釋結果和ESTScan軟件分析結果完成對序列的功能注釋。

123AhGA2ox基因克隆提取魯花14果針的RNA，利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒反轉錄得到花生果針cDNA。根據轉錄組測序獲得的GA2ox基因片段，設計5′-RACE引物：outer：GGTGGCACTGAAACCCAAC

TCCTATCTC；inner：GGAGGGTAATGGTTGAGCCTGAAGACTG。

以cDNA為模板進行RACE擴增。PCR程序為：第一輪：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25個循環；72℃ 5 min。以第一輪PCR產物為模板進行第二輪PCR擴增，PCR程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環；72℃ 5 min。

分析測序結果后設計克隆AhGA2ox全長引物：AhGA2oxF： CTTGTGTGTG TTCTAACTTCCA，AhGA2oxR： CCTATGACGCCACGACTT，以花生cDNA為模板擴增AhGA2ox基因全長。

124AhGA2ox基因序列分析利用Premier 50設計PCR引物。AhGA2ox基因的同源性分析使用NCBI的在線分析工具Blastn和Blastp；Expert Protein Analysis System在線服務用于分析AhGA2ox基因的編碼蛋白；使用在線軟件ProtScale（http：//usexpasyorg/cgi-bin/protscalepl）對AhGA2ox蛋白的疏水性進行分析； 用TMHMM和SignalP分別對AhGA2ox跨膜結構和信號肽區域進行預測；利用CluscalW和MEGA50進行AhGA2ox基因的多序列比對并構建進化樹。

125qRT-PCR分析qRT-PCR反應以花生不同發育時期的cDNA作模板，以組成型表達的花生AhActin基因作為內參，目的基因和內參基因引物序列為：AhGa2oxF： ACCCACATTCCCTACATCC， AhGA2oxR： GACCTTGAAGAAGCCATAGTC， AhActinF： GTCATCGTCATCCTCTTCTC， AhActinR： CATTCCTGTTCCATTGTCAC。采用FastStart SYBR Green試劑盒（Roche）按說明書進行操作。

用ABI PRISM 7900HT實時定量PCR儀進行反應，反應程序為：步驟1預變性95℃ 10 s；步驟2兩步法擴增95℃ 5 s，60℃ 1 min，40個循環；步驟3熔解曲線95℃ 0 s，60℃ 15 s，95℃ 0 s。每個反應管均設置重復管，重復試驗3次。根據溶解曲線檢測PCR產物的特異性。基因表達水平通過 2-△△CT 方法計算。

2結果與分析

21AhGA2ox基因全長的獲得

通過轉錄組測序，總共獲得了72 527 條unigenes。序列聚類分析和BlastX比對結果顯示其中一條820 bp的序列注釋為GA2ox，與其他植物GA2ox基因相比5′端缺少大約380 bp，利用RACE技術獲得該序列的5′-末端，拼接后設計引物克隆獲得AhGA2ox的全長開放閱讀框（ORF）1 014 bp （圖1）。

22AhGA2ox蛋白序列分析

利用Expert Protein Analysis System在線服務對AhGA2ox進行分析，結果表明AhGA2ox編碼的蛋白含338個氨基酸，分子量為379 kD，等電點為844。由序列分析可知，該蛋白含有20種氨基酸（表1），疏水性氨基酸占453%，親水性氨基酸占386%，堿性氨基酸占13%，酸性氨基酸占98%。其中有16個含S氨基酸。

將花生GA2ox的序列與其他10種植物GA2ox蛋白序列進行同源比對，發現不同物種間GA2ox的同源性較低，花生與其它植物的GA2ox只有60%左右的相似性（圖2）。為了確定AhGA2ox的進化位置，用11種植物GA2ox氨基酸序列構建系統進化樹（圖3），結果顯示花生GA2ox與同屬豆科的紅豆GA2ox和豇豆GA2ox親緣關系較近。

使用TMHMM在線預測分析后發現，AhGA2ox不存在信號肽序列和跨膜結構，預示該蛋白在細胞內不會發生遷移，該結果與DNS（http：//mendelimpacat/sat/DNS/DNShtml）的在線服務預測結果一致。用Predict Protein（http：//wwwpredictproteinorg）網絡服務器對AhGA2ox編碼的蛋白進行可溶性分析，結果表明有582%的氨基酸殘基暴露在外，可與溶劑接觸，可判斷該蛋白為可溶性蛋白。利用predict protein在線服務對AhGA2ox進行二級結構預測，結果表明在GA2ox蛋白中，螺旋結構占2493%，折疊結構占1632%，環肽鏈占5875%。GA2ox與2-酮戊二酸相結合的保守序列，基本由折疊結構和環肽鏈結構組成。

利用Expasy的ProtScale在線預測AhGA2ox的疏水性（圖4），結果表明該蛋白的疏水性最大值為2322，最小值為-2344。從圖中可以看出，AhGA2ox編碼蛋白的疏水區域與親水區域是交替出現的，在第180個氨基酸附近的疏水區域可能與GA2ox的功能結構域有關。

23AhGA2ox的表達模式分析

本研究通過qRT-PCR方法檢測了AhGA2ox的表達情況，AhActin為參照基因。結果表明，花生GA2ox在果針、花、莖、葉、根、種子中都有表達（圖5）。根據該基因各個組織的Ct值，經2-ΔΔCt法處理數據后發現AhGA2ox在成年期植株的葉中表達量最高，其次，在根及入土3天的果針中表達也相對較高，表達量最低的是成年的莖。

1：未入土果針；2：入土3天果針；3：入土9天果針；4：花；

5：成年期莖；6：幼年期莖；7：成年期葉；8：幼年期葉；9：根；10：種子

3討論

GA2-氧化酶是在赤霉素合成過程中催化生物活性赤霉素失活的關鍵酶[13]，在小麥、番茄、煙草等植物中異源表達AtGA2ox會使植株矮化[14～16]。GA2-氧化酶基因屬于20G-Fe（Ⅱ） oxygenase superfamily基因家族，其中擬南芥中鑒定了8個不同的GA2ox基因[17]，大豆中注釋GA2ox的有7個基因。1999年Martin等[18]人在豌豆中鑒定了兩個GA2ox的cDNA，2003年Agrawal等鑒定了兩個水稻GA2ox基因。

本研究克隆得到花生的一個GA2ox基因，通過對這個基因的生物信息學分析，可以確認它是GA2ox基因家族中的一員，是一種氧化還原酶類的雙加氧酶，以2-酮戊二酸為底物，催化赤霉素失去生物活性。AhGA2ox具有該蛋白家族共同的結構特點，含有保守的20G-FeⅡ-Oxy蛋白結構域，還有高度保守的與2-酮戊二酸結合位點（Arg-272、Ser-274）和Fe2+結合位點（His-205、Asp-207、His-262），這表明AhGA2ox屬于GA2-氧化酶家族。

研究表明，擬南芥8種GA2ox基因表達模式有所不同，如AtGA2ox1和AtGA2ox2在花、莖和莢果中表達量高，在葉中表達量低；而AtGA2ox3在這些組織中檢測不到表達。我們對花生GA2ox表達分析研究發現，在花生幼年期的各組織中表達量較低，而在成年期的葉片和根中表達量較高。赤霉素在植物生長發育過程中起重要作用，而AhGA2ox表達模式的不同暗示AhGA2ox通過負調控赤霉素合成，在花生不同發育時期、不同組織中起作用。另外，在花生莢果發育過程中，果針入土后3天時GA2ox的表達量明顯升高，暗示赤霉素在花生莢果發育初期起到重要的調控作用。

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