高壓靜電場對金針菇原生質體再生的影響

摘要：以白金1號為試材，研究了高壓靜電場對金針菇原生質體再生的影響。結果表明，經1 000 kV/m高壓靜電場處理金針菇原生質體（3904×107個/ml）20 min，可提高原生質體的再生率。

關鍵詞：高壓靜電場；原生質體；再生

中圖分類號：S646.1+5文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0084-03

近年來，靜電場的生物學效應問題越來越受到重視，國內外學者做了大量的研究。在宏觀方面，很多實驗結果都證明靜電場對生物體，尤其對一些農作物有明顯的作用效應，但劑量不同，生物效應不同。在微觀方面，不少學者從不同的角度對其作用機理作了初步探討，但多集中在蔬菜、作物等種子處理上，在食用菌上的應用研究較少[1，2]。

金針菇是我國最早進行人工栽培的食用菌之一，其肉質脆嫩、味道鮮美、營養豐富，深受人們喜愛。通過改進培養基、栽培工藝、出菇管理條件等，金針菇的產量得到提高。但隨著生產規模的擴大，尤其是工廠化、周年化栽培模式的出現，對優質、高產菌種的需求越來越迫切，而傳統育種手段周期長、成本高，制約著金針菇新品種的育成[3]。

20世紀60年代出現了原生質體融合技術，通過脫壁后不同遺傳類型的原生質體在融合劑的誘導下融合，最終達到部分或整套基因組的交換和重組，產生新的品種和類型。與傳統雜交育種相比，原生質體融合可以使遠緣雜交成為可能，遺傳物質亦可進行較完整的交換，且參與融合的親本數不局限于2個。

目前應用原生質體技術進行食用菌育種已有報道：任軒等以杏鮑菇和平菇為親本菌株，采用雙親滅活原生質體融合技術選育出高漆酶活性且遺傳穩定的融合菌株[4]；李艷紅等利用原生質體紫外誘變進行了猴頭菌新菌種的研究[5]，但尚未見利用高壓靜電場對金針菇原生質進行處理的研究報道。本試驗研究了高壓靜電場對金針菇原生質體的影響，以便為金針菇原生質體融合育種提供技術支持。

1材料與方法

11供試菌株

金白1號（本所保存）。

12培養基

液體培養基（PDL）：馬鈴薯200 g，MgSO4 05 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 05 g，水1 L。

原生質體再生培養基（RM ）：馬鈴薯 200 g，酵母膏 20 g，蛋白胨20 g，蔗糖 20 g，MgSO4 15 g，甘露醇 10932 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 50～60。

13試劑

高滲穩定劑（等滲液）：06 mol/L 甘露醇；溶壁酶（lywallzyme，廣東省科學院微生物研究所）；無菌蒸餾水。

14儀器及其他用具

滅菌備用器具：1 ml、200 μl 槍頭，5 ml 注射器（內塞脫脂棉），三角瓶，燒杯，濾紙，5 ml離心管。

其他：1 ml 、200 μl移液槍，接種針，涂布棒，鑷子，28℃ 水浴鍋，離心機，恒溫培養箱，靜電場發生設備，游標卡尺等。

15試驗方法

151溶壁酶的配制 稱取015 g溶壁酶， 加入無菌06 mol/L甘露醇10 ml，再用022 μm細菌濾膜過濾于50 ml 三角瓶中，制成15%的溶壁酶液。

152原生質體的制備將供試菌株接種于裝有PDL 培養基的三角瓶中，28℃靜置培養5～7 d。將培養好的液體培養物倒入離心管，用無菌水洗滌2～3次，再用06 mol/L 甘露醇洗滌2～3次， 將菌絲體上的水用無菌濾紙吸干后，分成小塊，裝入5 ml無菌離心管。

按250 g菌絲體需2 ml 酶液的量加入15%溶壁酶液，28℃水浴脫壁3 h，間歇30 min振蕩一次。將酶裂解液倒入5 ml注射器管中（內加脫脂棉），過濾于另一干燥離心管，離心后洗滌2～3次，最后加06 mol/L的甘露醇 2～3 ml懸浮，制得原生質體原液。 用06 mol/L甘露醇將原生質體原液梯度稀釋，制得原生質體10、100倍稀釋液。

153原生質體的高壓靜電場處理及再生將原生質體原液及其10倍、100倍稀釋液按高壓靜電場處理條件分組，分別取100 μl均勻涂布于再生平板上。

高壓靜電場處理：按靜電場強度500、750、1 000 kV/m分3個處理組，空白對照（不處理）1組，每組3個重復，處理20 min。

原生質體再生：各處理組經高壓靜電處理后與對照組一起置于28℃培養箱中培養，培養至第6天統計菌落數，計算原生質體再生率。

再生率（%）=再生菌落數/原生質體數×100

2結果與分析

21原生質體鏡檢計數結果

對原生質體10倍稀釋液進行鏡檢計數，結果見表1。

22不同靜電場處理對金針菇原生質體再生的影響

由表2可以看出，不同處理組合對金針菇原生質體的再生率影響不同，以10倍稀釋液、1 000 kV/m處理20 min效果較好，再生率可達 00124%，其它處理與對照差異不大。原生質體濃度對試驗結果影響較大，以10倍稀釋液（3904×107個/ml）較好，原液濃度過高計數、分離困難，100倍稀釋液則濃度過低，原生質體基本不能再生。

自然界中的一切物體都處于靜電場的作用之下，靜電場對生物體的生命活動具有重要的影響，環境電場的變化，特別是外加的高壓靜電場，會對生物體的電荷分布、排列、運動發生改變，從而影響生物體的方方面面。

目前的研究認為靜電場主要通過以下幾方面發揮作用：一是改變酶的活性。高壓靜電場能夠直接作用于酶，使得酶的活力和構象發生變化，合適的高壓靜電場能夠使酶的活力增高，而過高的高壓靜電場能使酶的活力降低。高壓靜電場對酶的作用基本上是可逆的，經高壓靜電場處理的酶穩定性增加[6，7]。二是改變細胞膜的通透性。靜電場產生的電位差能促進ATP的合成，觸發酶類的活化，使細胞內外通透性增加，有利于營養物質的吸收利用，產生生物效應和增產效果[8，9]。三是影響遺傳物質。一定強度的靜電場能夠縮短細胞有絲分裂周期，提高細胞分裂速度，產生植物細胞的多核現象，引起植物細胞的染色體畸變[10]。

本試驗表明，利用1 000 kV/m高壓靜電場處理金針菇原生質體20 min，可提高金針菇原生質體的再生率。至于高壓靜電場是否影響金針菇原生質體的遺傳物質，經高壓靜電場處理后的再生體農藝性狀是否改變，還需進一步驗證。

參考文獻：

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[3]宋冬靈，曾憲賢，呂杰，等 金針菇遺傳育種研究進展 [J]種子，2007，26（5）：52-54

[4]李艷紅，李莉 原生質體紫外誘變選育猴頭菌新菌種的研究[J]山東農業科學，2006，2：42-43

[5]任軒，賈樂，宋振，等雙親滅活原生質體電誘導融合法選育高漆酶活性菌株[J]山東農業科學，2008，8：66-69

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[7]郭維生， 楊性愉高壓靜電場對α-淀粉酶構象的影響[J]內蒙古大學學報（自然科學版），2001，32（3）：349-351

[8]溫尚斌， 馬福榮 高壓靜電場促進植物吸收離子機理的初步探討[J]生物化學與生物物理進展，1995，22（4）：377-379

[9]易偉松，謝菊芳，江厚敏，等高壓靜電場對離子跨膜轉運的影響機理再探[J]湖北大學學報（自然科學版），2003，25（1）：46-48

[10]郭維生，楊體強高壓靜電場對鯡魚DNA X射線衍射譜的影響[J]內蒙古大學學報（自然科學版），2001，32（3）：258-260