利用回交轉育培育黃淮稻區抗蟲轉基因水稻新品系

摘要：利用黃淮稻區主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮稻88為受體親本，選擇以秈稻明恢63為背景的轉基因抗蟲材料TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）和以粳稻中花11為背景的轉基因抗蟲材料RJ- 5（cry1C）為供體，分別進行雜交和多代回交。每一世代后代單株，通過涂抹Basta抗性篩選，結合PCR鑒定跟蹤抗蟲目的基因以及田間抗蟲性鑒定、農藝性狀選擇，培育出來源于TT51帶有cry1Ab/1Ac基因的抗蟲穩定株系3個，來源于T2A-1帶有cry2A基因的穩定株系2個，來源于T1C-19帶有cry1C基因的穩定株系3個，來源于RJ- 5帶有cry1C基因的抗蟲穩定株系2個。這些株系于田間均表現出很好的抗蟲性狀和優質豐產性狀，為黃淮稻區抗蟲轉基因水稻育種奠定了基礎。

關鍵詞：抗蟲轉基因水稻；回交轉育； Basta；PCR檢測；抗蟲性鑒定

中圖分類號：S511.035.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0038-04

水稻是最主要的糧食作物，世界上超過一半人口以其為主食。鱗翅目害蟲一直是水稻的最大威脅之一。據統計，每年由于蟲害造成的損失達數億美元[1]。

由于水稻本身尚未發現有效的抗蟲基因，傳統育種面臨很多困難。目前，Bt毒蛋白基因是使用最廣泛的基因，用轉基因的方法將Bt毒蛋白基因導入常規水稻，可使水稻對螟蟲的抗性提高[2]。轉基因植物中的外源基因在自交T1代群體中一般遵循孟德爾分離規律，在轉基因植株與常規品種的雜交后代中，也能以單顯性基因方式遺傳[3，4]。因此可以通過對轉基因株系與主栽品種進行多次回交轉育和選擇，使輪回親本基因頻率逐漸增加，從而獲得具有良好抗蟲性和優質豐產性狀的改良新品種[6，7]。

本課題組利用已獲得的三個以秈稻明恢63為遺傳背景的抗蟲轉基因株系和一個以粳稻中花11為背景的抗蟲轉基因材料分別與黃淮稻區主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮稻88進行雜交和回交，利用抗蟲基因cry2A和cry1C與Bar基因緊密連鎖的關系[5]，對其雜交和回交后代進行了Basta涂抹篩選，結合PCR鑒定跟蹤抗蟲目的基因、田間抗蟲鑒定、農藝性狀選擇，育出了農藝性狀優良的抗蟲轉基因水稻新品系。

1材料與方法

11親本材料

以華中農業大學提供的單拷貝轉Bt基因水稻株系 TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）、RJ-5（cry1C）為父本，以黃淮稻區主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮稻88為母本分別進行雜交與回交，獲得F1、BC1F1、 BC2F1、BC3F1、BC3F2等世代。

12雜交及回交轉育

在8月中下旬，選取正處于開花期的稻穗，以黃淮稻區主栽品種為母本，46℃溫水去雄，以轉Bt基因水稻株系為父本分別進行雜交獲得F1代，再以黃淮稻區主栽品種為輪回親本，連續回交獲得BC1F1、BC2F1、BC3F1等世代以及自交后代BC3F2。在開花前對每一個雜交或回交后代單株均進行除草劑Basta抗性檢測和PCR分子檢測跟蹤抗蟲基因，結合田間篩選，從中選擇與親本外觀形狀相似的轉基因陽性植株再與輪回親本連續回交，或自交純合。

13Basta抗性選擇

待轉基因水稻長至20 cm左右時，進行除草劑Basta（有效成分PPT）抗性檢測，PPT濃度為1 g/L，用棉簽雙面浸蘸然后涂在植株的葉片上，3～5 d后統計抗性株數及敏感株數。

14PCR分子檢測

選取Basta檢測陽性植株，摘取幼嫩葉片，充分研磨，利用TPS法[8]提取DNA，備用。根據三個抗蟲基因序列設計三對特異PCR引物，25 μl反應體系，94℃預熱5 min，35個循環（94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min），72℃延伸5 min[9]。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后在紫外透射儀下觀察。

15轉基因植株的田間抗蟲鑒定

在不用任何藥劑防治螟蟲的情況下，于螟蟲高發期田間調查稻縱卷葉螟危害情況及其引起的白穗發生情況，統計白穗率。

16田間種植及農藝性狀考察

在濟南飲馬泉試驗農場種植轉基因水稻，小區面積為667 m2，重復2次，同時種植主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮稻88為對照。田間管理同大田，但不施用任何農藥防蟲防病。考察的農藝性狀有生育期、株高、穗長、穗粒數、千粒重和產量等。

2結果與分析

21轉育經過

2009年配制雜交組合TT51 （cry1Ab/1Ac）/圣稻13、TT51 （cry1Ab/1Ac）/圣稻15、TT51 （cry1Ab/1Ac）/鎮稻88、T2A-1（cry2A）/圣稻13、T2A-1（cry2A）/圣稻15、T2A-1（cry2A）/鎮稻88、T1C-19（cry1C）/圣稻13、T1C-19（cry1C）/圣稻15、T1C-19（cry1C）/鎮稻88、RJ-5（cry1C）/圣稻13、RJ-5（cry1C）/圣稻15、RJ-5（cry1C）/鎮稻88。2010年分別以圣稻13、圣稻15、鎮稻88為輪回親本進行回交，獲得BC1F1，同年海南南繁獲得BC2F1，2011年獲得BC3F1，2012年自交獲得BC3F2。

22Bt轉基因植株除草劑抗性鑒定

對雜交和回交后代單株進行除草劑Basta抗性鑒定。PPT濃度為1 g/L[10]，單面涂抹葉片，3～4 d調查，結果顯示：轉Bt基因且帶有Bar基因標記的T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）、RJ-5（cry1C）株系與黃淮海主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮稻88的雜交后代F1分離群體中Basta的陰陽性分離比例按照1∶1分離，由此表明三個外源基因均為單顯性基因且遵循孟德爾分離規律。

23Bt轉基因植株的PCR檢測

由于TT51 （cry1Ab/1Ac） 轉基因株系無Bar基因標記，所以需對所有以TT51 （cry1Ab/1Ac）轉基因株系為父本的雜交和回交后代單株進行PCR分子檢測跟蹤Bt基因，對其他三個轉基因株系為父本的雜交及回交后代選取Basta檢測為陽性的轉基因株系進行PCR分子檢測，選取陽性植株。檢測顯示Basta檢測陽性的植株PCR分子檢測均為陽性，表明了Bar基因和目的基因cry2A和cry1C是協同表達的。部分陽性植株PCR檢測結果見圖1、圖2、圖3。

24Bt轉基因植株的田間抗蟲性鑒定

田間種植觀察TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）及RJ-5（cry1C）轉基因株系與黃淮稻區主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮稻88分別雜交的后代F1和回交世代BC1F1、BC2F1、BC3F1及BC3F2代材料。插秧時分單株插栽，涂抹Basta 5 d后根據Basta抗性表現，掛牌標記陰陽性植株，見圖4。田間自插秧到收獲未施任何農藥。在稻縱卷葉螟大發生時期，轉基因水稻幾乎沒有受到卷葉螟的危害，而對照和非轉基因水稻卷葉螟危害嚴重，黃淮稻區品種圣稻13、圣稻15和鎮稻88白穗率（死亡率）達到50%，而轉基因水稻新品系白穗率相當低，小于01%，如圖5。田間調查白穗率發生情況，結果如表1。

25回交和自交后代的田間農藝性狀和產量表現

回交轉育的目的是為育出轉基因水稻新品系，所以在對抗性選育的同時，更注重了對產量、品質等綜合性狀的選育。對獲得的3個源于TT51帶有cry1Ab/1Ac基因的抗蟲穩定株系，2個來源于T2A-1帶有cry2A基因的穩定株系，3個來源于T1C-19帶有cry1C基因的穩定株系，2個來源于RJ-5帶有cry1C基因的抗蟲穩定株系，2012年在濟南飲馬泉試驗農場按小區種植，每小區面積為667 m2，同時種植主栽品種圣稻13、圣稻15和鎮稻88 為對照。田間管理同大田，但不施用任何農藥防蟲防病。考察的農藝性狀有生育期、株高、穗長、穗粒數、千粒重和產量等。通過回交轉育培育出的轉基因水稻新品系主要農藝性狀田間表現如表2所示。

3結論與討論

轉基因水稻成功運用取決于外源基因在植物體中能否保持遺傳的穩定性[11，12]。在水稻抗蟲育種方面，國內外相繼有不少獲得抗蟲轉基因植株的報道[13，14]。但由于轉化過程中諸多因素的影響，有些水稻品種很難轉化或轉化率很低[15，16]；有些雖獲得部分轉基因植株，但因轉基因植株農藝性狀不佳，難以直接應用于農業生產[17，18]。本研究將現代生物技術與傳統育種方法相結合，采用雜交、回交等方法將抗蟲基因轉入栽培品種中，為充分利用已獲得的抗性轉基因材料提供了廣闊的前景。本研究結果顯示，cry1Ab/1Ac、cry2A、cry1C基因及其介導的抗性在所有回交獲得的轉基因株系中均能穩定遺傳和表達，回交轉基因株系同樣表現出很強的抗蟲能力。利用回交轉育技術，已獲得多個優質、高產且抗性穩定的水稻新品系。本試驗中由于粳稻和秈稻品種雜交其后代的抽穗期很晚，不易收獲，故采用遮光處理方法并有效解決了抽穗期晚的問題。參考文獻：

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