葡萄糖對人牙周膜成纖維細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響

[摘要]目的：以體外培養的人牙周膜成纖維細胞（HPDLF）為研究對象，觀察不同濃度的葡萄糖對HPDLF中骨保護素（OPG）、核因子κB受體活化劑配體（RANKL）mRNA表達的影響，探討葡萄糖在牙槽骨吸收中的作用。方法：組織塊法體外原代培養HPDLF并鑒定，選擇4～8代的HPDLF作為實驗的靶細胞，不同濃度的葡萄糖（0、5.5、11.1、16.7、22.2、33.3mmol/l）干預HPDLF ，半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測HPDLF中OPG、RANKL mRNA的表達。結果：高濃度的葡萄糖可下調HPDLF中OPG mRNA的表達，呈劑量依賴性；可上調RANKL mRNA的表達，也呈劑量依賴性，且使RANKL/OPG mRNA的比值隨著葡萄糖濃度的增高而呈現持續上升的趨勢。結論：糖尿病時，牙周組織中高濃度的葡萄糖，可下調OPG 的表達，上調RANKL的表達，使RANKL/OPG 的比值升高，調節破骨細胞分化，刺激骨吸收，導致牙槽骨的破壞，加重牙周病的病情。

[關鍵詞]人牙周膜成纖維細胞；葡萄糖；骨保護素；核因子κB受體活化劑配體

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0071-04

The effects of high glucose on OPG and RANKL expression in human periodontal ligament fibroblasts

ZHANG Lan1，SUN Lin-lin2，DING Yan3，SONG Jian-ling2

（1.Department of Periodontics and Mucosal Diseases， Stomatological Hospitol of Xian Jiaotong University， Xi’an 710004，Shanxi，China；2. Stomatological Hospitol of Baoji；3. Department of oral medicine，Wuxi Mental Health Center）

Abstract： Objective To observe the effects of different concentrations of glucose on mRNA expression of osteoprotegerin （OPG） and receptor activator of NF-kappa B ligand （RANKL） in human periodontal ligament fibroblasts （HPDLF） and investigate the effects of glucose on alveolar bone absorption. Methods The primary HPDLF were cultured according to the method of tissue explant in vitro and identified by immunohistochemistry. HPDLF from passages four to eight were used for experiments. HPDLF were exposed respectively to different concentrations of glucose （0， 5.5， 11.1， 16.7，22.2， 33.3mmol/l）. The mRNA expression of OPG and RANKL in HPDLF was detected using semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） analysis. Results High concentrations glucose down-regulated mRNA levels of OPG and up-regulated the mRNA levels of RANKL dose-dependently. The ratio of RANKL mRNA to OPG mRNA also increased as the glucose concentration rose. Conclusion The high level glucose in periodontal tissue in diabetes mellitus could down-regulate OPG expression and up-regulated RANKL expression， increase the ratio of RANKL to OPG， activate the differentiation of osteoclasts and promote alveolar bone absorption， which might increase the susceptibility of diabetics to periodontal disease.

Key words：Human periodontal ligament fibroblasts；glucose；OPG ；RANKL

近年來對骨吸收機制的研究發現骨保護素（osteoprote gerin， OPG）及其配體核因子-κB受體活化劑配體（receptor activator of nuclear factor- κB ligand ，RANKL）是調節破骨細胞分化、成熟和骨吸收功能的關鍵因子，在生理性、病理性骨吸收中發揮著重要作用。OPG和RANKL能在人牙周膜成纖維細胞（Human periodontal ligament fibroblasts，HPDLF）中表達， 大多數細胞因子和激素可通過改變HPDLF中OPG和RANKL的合成，間接調控破骨細胞的分化和成熟。

糖尿病是由胰島素分泌異常而引起的內分泌代謝性疾病，高血糖是糖尿病最主要的特征，糖尿病可以引起全身性骨代謝紊亂，并導致骨質疏松癥。臨床發現伴發有糖尿病的牙周病患者牙周病變嚴重、牙槽骨吸收迅速、預后較差。那么糖尿病時牙周骨吸收的變化與牙周病時有何不同呢？究竟葡萄糖水平的變化對牙周病的進展及組織破壞程度有多大相關性呢？本實驗模擬生理及病理條件下不同的葡萄糖濃度，采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）檢測葡萄糖干預HPDLF后，OPG、RANKL mRNA的表達量，探討機體在高糖狀態下牙周組織中OPG、RANKL的變化情況，了解糖尿病時牙槽骨吸收的可能機理，為糖尿病和糖尿病伴牙周病患者的牙周防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試劑：D-葡萄糖、胰蛋白酶、氨卞青霉素、硫酸鏈霉素（Sigama公司，美國），胎牛血清（灝陽公司，天津），RT-PCR試劑盒、Biozol、Bio Marker I （博日公司，杭州），低糖DMEM干粉（Gibco 公司，美國），SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、波形蛋白單克隆抗體、角蛋白單克隆抗體 （博士德公司，武漢）。

1.2 人牙周膜成纖維細胞的原代培養及鑒定：本實驗采用司徒鎮強的組織塊法進行HPDLF的原代培養[1]。選擇12～18歲因正畸治療需要拔除的健康前磨牙，取材前征得患者的同意，告知其用途。牙齒拔出后，立即置于含無菌D-Hanks液（氨卞青霉素200μg/ml，硫酸鏈霉素200μg/ml）的培養皿中，反復沖洗，用無菌手術刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織，用眼科剪剪碎，然后將含有組織塊的DMEM培養液移入15ml離心管中，1200r/min離心5min，棄去上清液，加入適量含20%FBS的DMEM培養液，吹打混勻，移入預先鋪好一層半干FBS的培養瓶中，置于CO2培養箱中（5%CO2、37℃、飽和濕度），倒置培養4h后，向培養瓶中補加2ml含20%FBS的DMEM培養液，翻轉培養瓶，繼續培養。每2～3天更換含20%FBS的DMEM培養液一次，原代培養的細胞貼壁生長鋪滿瓶底約60%～80%時即可以傳代。取生長良好的第5代HPDLF，調整細胞密度為104個/ml接種到12孔培養板中央的蓋玻片上，待細胞融合達60%～70%，取出蓋玻片。HE染色觀察細胞形態，免疫組化SP法進行波形絲蛋白、角蛋白染色，光鏡下觀察可見細胞波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。

1.3 實驗分組：取生長良好的第5代HPDLF，調整細胞密度為5.0×105個/ml，接種于6只25ml玻璃培養瓶中，培養液為含10%FBS的DMEM，待細胞充分貼壁并達80%匯合時，換用無血清的DMEM繼續培養24h，使細胞同步化。按照葡萄糖的實驗分組改用含不同濃度葡萄糖的DMEM培養液（對照組：0mmol/l、1組：5.5mmol/l、2組：11.1mmol/l、3組：16.7mmol/ l、4組：22.2mmol/l、5組：33.3mmol/l）干預6組HPDLF，干預時間為24h。

1.4 RT-PCR檢測

1.4.1總RNA的提取和鑒定：選用BIOZOL常規提取HPDLF的總RNA，在 1.5%瓊脂糖凝膠中電泳（恒壓80V，電泳緩沖液為1×TAE）30min后，凝膠成像系統觀察電泳結果。取溶解后的總RNA，按照1∶20倍體積稀釋，5μl RNA+95μl RNase free H2O，在紫外分光光度計上分別讀取260 nm、280 nm的吸光度（OD）值。總RNA的純度為：OD（260）/OD（280）。總RNA純度的比值為1.8～2.0，說明所提取的HPDLF總RNA質量較好。

1.4.2 引物的設計與合成：人OPG、RANKL、β-actin的引物經Premier 5.0引物設計軟件設計，經GeneBank檢索引物序列及位點，分析核實后，由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成（見表1）。

1.4.3 反轉錄（RT）反應合成cDNA：操作在冰浴（4℃）下進行，在PCR管加入5×RT Buffer2.0μl、dNTP Mixture （10mM） 1.0μl、Random Hexamer Primer0.5μl、RNase inhibitor （40U/μl） 0.5μl、AMV Reverse Transcriptase0.5μl、實驗樣品RNA2.5μl、RNase free H2O 3.0μl組成總體積10μl體系，瞬時離心數秒，置于PCR擴增儀上進行反轉錄（RT）反應合成cDNA。反應條件：25℃ 10min、50℃ 45min（逆轉錄反應）、95℃ 5min（滅活逆轉錄酶）、4℃ 5min。

1.4.4 PCR反應：配制PCR反應液：10×PCR Buffer （含Mg2+）2.5μl、dNTP Mixture （10mM） 0.5μl、上游特異性引物（5μM） 0.5 μl、下游特異性引物（5μM） 0.5μl、Taq mix DNA polymerase0.5μl、RT產物2.5μl、dd H2O 18μl，總體積25μl。進行PCR反應：94℃預變性3min后開始循環，94℃變性30s→55或58℃退火30s→72℃延長1min，擴增35個循環，最后72℃延伸5min。退火溫度：OPG 55℃；RANKL 58℃；β-actin 55℃。

1.4.5 瓊脂糖凝膠電泳：向PCR產物（25μl）中加入6×Loadding Buffer 5μl，振蕩器上混勻。按照順序加入Bio Maker Ι和PCR產物各5μl于凝膠孔中，電壓80V，電泳50min，置于紫外透射儀下，采用Dolphin-1D凝膠成像分析系統掃描、分析各條帶光密度值。

1.5統計學分析：應用Spss13.0軟件進行統計分析。實驗數據以 x±s表示，多組均數的比較采用單因素方差分析，并對各組數據進行兩兩比較（LSD-t），P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人牙周膜成纖維細胞總RNA的檢測：實驗所提取的HPDLF總RNA，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳結束后，凝膠成像系統觀察可見有兩條完整清晰的RNA電泳條帶，即28S和18S，且28S條帶的亮度和寬度約為18S條帶的兩倍，表明所提取的總RNA完整性很好。在紫外分光光度計分析，結果如下：總RNA OD（260）=1.43；總RNA OD（280）=0.72；總RNA純度：OD （260）/OD（280）≈2，說明總RNA質量較好、純度較高。

2.2 葡萄糖對人牙周膜成纖維細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響：OPG、RANKL、β-actin的擴增產物分別為342 bp、442 bp、179 bp，見圖1。各組樣本OPG、RANKL目的基因條帶和β-actin參照基因條帶像素值之比為OPG、RANKL mRNA表達的相對含量，見表2。

2.2.1 葡萄糖濃度下調HPDLF中OPG mRNA的表達，呈濃度依賴性。5.5mmol/l濃度的葡萄糖對OPG mRNA表達的作用與對照組（0mmol/l）相比，無差異（P>0.05）。而11.1mmol/l的葡萄糖可下調OPG mRNA的表達（P<0.05），并在16.7mmol/l、22.2mmol/l、33.3mmol/l時隨著濃度的增加下調作用逐漸明顯，呈濃度依賴性（P<0.05）（見表2）。

2.2.2 葡萄糖濃度上調HPDLF中RANKL mRNA的表達，呈濃度依賴性。5.5mmol/l的葡萄糖對RANKL mRNA的表達的作用與對照組（0mmol/l）相比，無明顯差異（P>0.05）。而11.1mmol/l的葡萄糖可上調RANKL mRNA表達（P<0.05）， 在16.7mmol/l、22.2mmol/l、33.3mmol/l時隨著濃度的增加上調作用逐漸明顯，并呈濃度依賴性（見表2）。

2.2.3 RANKL/OPG mRNA比值的變化：RANKL/OPG mRNA的比值隨著葡萄糖濃度的增高而呈現持續上升的趨勢。11.1mmol/l、16.7mmol/l、22.2mmol/l和33.3mmol/l的葡萄糖對RANKL/OPG mRNA比值的上調作用較對照組和5.5mmol/l的葡萄糖組均有顯著差異（P<0.05），且各組之間RANKL/OPG mRNA的比值均有顯著差異（P<0.05）（見表2）。

3 討論

牙周病和糖尿病是我國人群中的兩大常見病和多發病，近年來發病率一直呈上升趨勢，并且隨著年齡的增長嚴重程度也隨之加重。臨床研究表明，牙周病和糖尿病存在共同的危險因素、且相互影響互為高危因素。世界衛生組織已經將牙周病列為糖尿病的第六并發癥。因而牙周病與糖尿病關系的研究倍受關注。

高血糖作為糖尿病最基本的生化特性，在糖尿病及其慢性并發癥的發生、發展中扮演著重要角色。它可以提高破骨細胞的活性，加速骨吸收，引起骨代謝的紊亂，并導致骨質疏松癥[2]。牙周組織的破壞，最終也以牙槽骨的骨質喪失為結果。研究發現體內葡萄糖水平與牙周病的進展及組織破壞程度密切相關。

OPG是影響破骨細胞分化、成熟和調節骨代謝的關鍵因子，OPG的主要功能是抑制破骨細胞的分化和成熟破骨細胞的骨吸收活性并誘導其凋亡。RANKL的主要作用為刺激破骨細胞的分化和活性，抑制破骨細胞的凋亡。RANKL是目前發現的惟一能直接誘導破骨細胞分化、發育并參與破骨細胞功能調節的細胞因子。RANKL基因敲除的小鼠均出現異常的骨吸收，發生嚴重的骨質硬化[3]；而OPG基因敲除的小鼠在出生后出現骨質疏松，當加入重組OPG后能夠增加骨密度[4]。OPG和RANKL是骨代謝的最終效應因子[5]。機體通過調節RANKL和OPG合成的比例來調節破骨細胞的形成和活化，以達到骨吸收的動態平衡[6]。有許多細胞因子（白介素、腫瘤壞死因子）、激素（胰島素）和蛋白（成骨蛋白）等通過影響RANKL和OPG的表達來影響骨代謝[7-8]。

糖尿病是由胰島素分泌異常而引起的內分泌代謝性疾病，本實驗通過觀察生理和病理情況下不同濃度的葡萄糖對HPDLF中OPG、RANKL mRNA表達的影響。結果表明高濃度的葡萄糖呈濃度依賴性抑制OPG mRNA的表達，而人體生理濃度范圍（5.5mmol/l）的葡萄糖對OPG mRNA的表達無明顯影響。另一方面，葡萄糖呈濃度依賴性上調RANKL mRNA的表達，RANKL/OPG mRNA的比值隨著葡萄糖濃度的增高而呈現持續上升的趨勢，與葡萄糖對OPG mRNA的下調作用相比，葡萄糖對RANKL mRNA的上調作用更強大。

王加林、周瑋等研究發現高糖環境導致具有人成骨細胞表型特征的MG63細胞中RANKL表達增多，OPG的表達減少，從而導致骨質疏松[9]。王永蘭等通過對糖尿病大鼠的研究發現，糖尿病使牙槽骨局部OPG mRNA的表達降低、RANKL mRNA的表達升高，上調RANKL/OPG的比值，胰島素治療可以降低牙槽骨中RANKL/OPG的比值，減輕牙周組織炎癥反應，減弱牙槽骨吸收，提示血糖水平的增高可能是影響糖尿病大鼠牙槽骨吸收的危險因素之一。RANKL/OPG的相對濃度決定牙槽骨的骨吸收平衡，也說明糖尿病對牙槽骨吸收的影響是通過升高RANKL mRNA的表達和降低OPG mRNA的表達兩方面起作用[10]。這也與本實驗的結果相一致。糖尿病時牙周組織通過RANKL/OPG比值，間接調節破骨細胞的分化和功能，使骨代謝的平衡被打破，骨吸收大于骨形成，牙周組織局部的牙槽骨出現破壞和吸收。

Mahamed等發現OPG可以顯著減少在糖尿病小鼠中局部接種伴放線放線桿菌而引起的牙槽骨喪失，同時伴放線放線桿菌激活的CD4+T細胞中RANKL的表達顯著降低，因此OPG對糖尿病時牙槽骨的吸收有治療意義[11]。糖尿病伴牙周病的治療除了需要控制牙周局部的炎癥以外，血糖水平的控制對減少牙槽骨的喪失也至關重要。此外要加強人群糖尿病和牙周病患病的健康教育，充分認識到糖尿病是促使牙周病發生和發展的全身因素，早期控制糖尿病可有效避免或減少牙周炎的發生，提高糖尿病患者的生活質量[12]。

[參考文獻]

[1]司徒鎮強，吳軍正.細胞培養[M].北京：世界圖書出版公司北京公司，2004：58-100.

[2]Schwartz AV. Diabetes Mellitus： does it affect bone [J]. Calcif Tissue Int， 2003， 73（6）： 515-519.

[3]Wittrant Y， Theoleyre S， Couillaud S， et al. Relevance of an in vitro osteoclastogenesis system to study receptor activator of NF-kappa B ligand and osteoprotegerin biological activities [J]. Exp Cell Res， 2004， 293（2）： 292-301.

[4]Bucay N， Sarosi I， Dunstan CR， et al. OPG-deficientmice develop early onset osteoporosis and arterial calcification [J]. Genes Dev， 1998， 12（9）： 1260-1268.

[5]Katagiri T， Takahashi N. Regulatory mechanisms of osteoblast and osteoclast differentiation [J]. Oral Dis， 2002， 8（3）： 147-159.

[6]Hasegawa T，Yoshimura Y， Kikuiri T， et al. Expression of receptor activator of NF-kappa B ligand and osteoprotegerin in culture of human periodontal ligament cells [J]. J Periodontal Res，2002， 37（6）： 405-411.

[7]Hofbauer LC. Osteoprotegerin ligand and osteoprotegerin： novel implications for osteoclast biology and bone metabolism [J]. Eur J Endocrino，1999，141（3）：195-210.

[8]孫海燕， 張永寬，金作林，等.BMP- 2 對體外培養人牙囊細胞表達OPG 和RANKL 的影響[J].中國美容醫學，2010，19（9）：1313-1316

[9]周瑋，王加林，姬秋和，等.葡萄糖、雌二醇對MG63細胞株TRAIL，OPG，OPGL mRNA表達的影響[J].中國骨質疏松雜志，2008，14（9）：638-641.

[10]王永蘭，吳陳炫，靳趁心，等.胰島素治療對糖尿病大鼠牙槽骨RANKL/OPG mRNA影響的研究[J].現代口腔醫學雜志，2008，22（4）：973-976.

[11]Mahamed DA， Marleau A， Alnaeeli M， et al. G （-） anaerobes-reactive CD4 （+） T-cells trigger RANKL-mediated enhanced alveolar bone loss in diabetic NOD mice [J]. Diabetes， 2005， 54（5）： 1477-1486.

[12]閆大鈞. 2 型糖尿病患者牙周炎認知情況調查[J]. 中國美容醫學，2011，20（6）：986-988.