RGDS對人牙周膜成纖維細胞生物學(xué)行為的研究

[摘要]目的：觀察精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-絲氨酸（RGDS）對人牙周膜細胞生物學(xué)行為的影響，探討RGDS的作用機制及其應(yīng)用于牙周治療的可行性。方法：采用細胞培養(yǎng)、固相結(jié)合分析等方法，觀察RGDS對牙周膜細胞的黏附、伸展以及增殖、堿性磷酸酶（ALP）的影響。結(jié)果：RGDS可促進牙周膜細胞的黏附、伸展，在濃度為25～100mg/L時作用顯著（P<0.01）， 在濃度為50～100mg/L時可明顯促進PDL細胞增殖（P<0.05），濃度為25～100mg/L時顯著提高PDL細胞的ALP活性（P<0.05）。結(jié)論：RGDS對牙周膜細胞的黏附、伸展、增殖及ALP活性均有促進作用，且其促黏附、伸展的作用更為顯著。

[關(guān)鍵詞]RGD；人牙周膜細胞；黏附；增殖；堿性磷酸酶

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0054-03

The biological effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine acid on periodontal ligament cell

BI Ying-chun，HE Yu-hong，XI Lan-lan

（Department of Stomatology，General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese，Jinan 250031，Shandong，China）

Abstract： Objective To observe the effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine （RGDS） peptides on the biological behaviors of human periodontal ligament cells（PDL） so as to discuss the mechanism of RGDS and the feasibility of its applications in periodontal therapy. Methods The effects of RGDS on periodontal ligament cells adhesion，extension and as well as the effects on ALP were observed by cellular culture and solid bond phase analysis. Results RGDS could promote PDL adhesion and extension with significance at the concentration of 25～100mg/L（P<0.01）； at the concentration of 50～100mg/L，it could significantiy promote PDL prolifacation（P<0.05）； at the concentration of 25～100mg/L，it could significantly increase ALP activity（P<0.05） of PDL. Conclusion RGDS can promote the adhesive，extension and proliferation as well as ALP activity of PDL，and moreover，it has more significant functions in adhesive and extension promotion.

Key words：arginlie-glycine-aspartic；human periodontal ligament （PDL） cells； adhesion； proliferation； alkaline phosphatase

精氨酸 -甘氨酸-天門冬氨酸（Arg-Gly-Asp， RGD）三肽是多種細胞跨膜蛋白整合素的特異性配體，許多黏附蛋白所共有的細胞間及細胞-細胞外基質(zhì)識別的最小序列，這一序列在介導(dǎo)細胞黏附、遷徙和生長方面起重要作用。牙周膜細胞在牙根面上的附著和增殖是牙周組織新附著的關(guān)鍵，本實驗?zāi)康氖怯^察離體細胞培養(yǎng)條件下，外源性RGDS對牙周膜細胞的影響，為進一步的臨床研究工作提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料：RGDS（Sigma）， 96孔培養(yǎng)板（Coster）， DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（FCS杭州四季青生物工程研究所）， 酶聯(lián)免疫檢測儀（DG3022A）， 牛血清白蛋白（BSA，博士德公司），噻唑鹽（MTT Sigma），ALP試劑盒，倒置顯微鏡（Olympus，Japan）。

1.2 人PDL的體外培養(yǎng)：取13～17歲因正畸需要拔除的新鮮前磨牙，隨即在無菌條件下用PBS緩沖液（含青、鏈霉素各1000U/ml）浸泡5～10min，并沖洗2次，除去血液，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成1mm3碎塊，均勻鋪于培養(yǎng)瓶底，瓶底向上，加入適量含100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在飽和濕度、50ml/LCO2、950ml/L空氣、37℃標準環(huán)境下孵育2h，翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)至長出牙周膜細胞。用2.5g/L胰蛋白酶消化法進行傳代，用免疫組化SABC法進行角蛋白和波形絲蛋白染色，波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源。取第4代細胞用于實驗。

1.3 PDL細胞黏附性的測試--固相結(jié)合分析[1]：將RGDS溶于PBS液，分別制成100mg/L，50mg/L， 25mg/L，12.5mg/L4種濃度，每濃度為一實驗組。將各濃度組按每孔50μl包被96孔板，每種濃度4孔，陰性對照為10g/L BSA。將96孔板置于4℃，過夜。用PBS液洗96孔板各孔2次，加10g/L BSA，37℃封閉1h，PBS再洗2次。取第4代人PDL細胞，2.5g/L胰酶消化，離心，收集細胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液吹懸細胞，形成5×108/L的細胞懸液，以每孔100μl接種于96孔板，37℃，50ml/LCO2條件下培養(yǎng)120min。取出培養(yǎng)板，PBS洗2次以去除未貼壁的細胞，2.5g/L胰酶消化，離心，將細胞懸浮于200μl無血清DMEM，血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，計算細胞總量。

1.4 PDL細胞伸展性的測試：實驗分組及96孔板的包被與實驗方法1.3相同，用無血清DMEM調(diào)整細胞濃度至107/L，每孔接種100μl， 標準環(huán)境下孵育120min，倒置顯微鏡下觀察各孔并照相。計數(shù)伸展細胞（即至少有一個胞漿突起的細胞）數(shù)和未伸展細胞數(shù)，每組至少計數(shù)100個細胞，計算伸展細胞的百分率。

1.5 RGDS對PDL細胞增殖的影響：實驗分組及96孔板的包被與實驗方法1.3相同，用無血清DMEM調(diào)整細胞濃度至107/L，每孔100μl接種于96孔板，10ml/LDMEM培養(yǎng)24h后，PBS 洗去未黏附細胞，重新加入10ml/L胎牛血清DMEM100μl，將96孔板置37℃、50ml/LCO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)5天后，MTT法測不同濃度RDGS對PDL細胞的影響。

1.6 RGDS對PDL細胞堿性磷酸酶（ALP）的影響：將PDL細胞按1.5的方法培養(yǎng)5天后， PBS洗3次，每孔加1ml/L TritonX-100 50μl，4℃過夜。次日每孔加堿性磷酸酶抗體100μl，37℃、50ml/LCO2孵育30min，加0.2mol/LNaOH 50μl終止反應(yīng)。酶聯(lián)免疫檢測儀410nm檢測A值。

1.7 數(shù)據(jù)分析：運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS10.0進行組間t檢驗， P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 RGDS對PDL細胞黏附性和伸展性的影響：如表1所示，隨著RGDS濃度增加，其促進PDL細胞的黏附率的作用逐漸增強，當濃度為12.5mg/L時，與對照組相比較，既有促進細胞黏附作用（P<0.05）在濃度為25mg/L時，差異顯著（P<0.01），說明能有效促進PDL細胞的黏附。

細胞伸展性實驗也說明，在RGDS濃度為12.5mg/L時，即有促進細胞伸展功能（P<0.01），濃度為25mg/L時，有50%以上細胞處于伸展狀態(tài)。在倒置顯微鏡下觀察，細胞在RGDS上伸展良好，細胞有一個或幾個突起，胞體呈梭形、多角形，未伸展的圓形細胞較少，而對照組的細胞則大多數(shù)呈圓形，無胞漿突起，即細胞伸展不良（圖1～3）。

2.2 RGDS對PDL細胞增殖和ALP的影響：RGDS在50～100mg/L可明顯促進細胞增殖，濃度在25～100mg/L明顯提高HPDL細胞的ALP的活性。見表2。

3 討論

本實驗運用固相結(jié)合分析技術(shù)，將RGDS固定于96孔板上，為排除血清中某些因素對實驗結(jié)果的影響，在黏附和伸展實驗中采用無血清的DMEM，在增殖和ALP活性檢測時，因培養(yǎng)時間較長（5天），采用細胞能耐受的1%胎牛血清濃度。實驗結(jié)果顯示：在濃度為25mg/L可顯著促進PDL細胞的黏附、伸展，而較高濃度的促進作用卻不明顯，可能在此濃度時細胞膜上受體位置已飽和，再增加RGDS并不能使黏附率明顯上升。而細胞伸展性也顯示，當RGDS濃度達到25mg/L時，細胞在2h的伸展率達到了50%以上，倒置顯微鏡下可見經(jīng)RGDS處理過的細胞胞體呈梭行或多角性，既細胞有一個以上的突起，呈現(xiàn)良好的伸展狀態(tài)。而未經(jīng)RGDS處理的對照組細胞形態(tài)呈圓形，無突起或僅有少量突起，細胞伸展狀態(tài)不佳。

精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）是細胞外基質(zhì)中許多黏附蛋白所共同含有的一個三肽序列，它是黏附蛋白與細胞表面特異受體蛋白相互作用的識別位點。這些細胞表面膜蛋白被稱為整合素（integrin）。整合素家族的分子都是由α、β兩條鏈由非共價鍵連接組成的異源雙體，為一跨膜結(jié)構(gòu)，一端連接細胞內(nèi)的骨架系統(tǒng)，另一端通過RGD識別位點與細胞外基質(zhì)連接，形成配體-整合素-細胞骨架跨膜信息系統(tǒng)，從而將細胞外基質(zhì)和細胞骨架連接起來，引起細胞內(nèi)一系列生化改變：如：酪氨酸磷酸化、胞漿堿化、鈣離子濃度提高、大量磷脂代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等，進而影響多種組織細胞功能調(diào)控，包括胚胎發(fā)育、細胞的伸展、移動、生長、分化、血栓形成、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列重要生理病理過程[2-3]。1984年，Pierschbacher和Ruolslahti[4]首次用實驗證實RGDS是纖維連接蛋白與其受體的特異性結(jié)合位點，可促進鼠腎成纖維細胞在生物材料表面的黏附，從此對于RGD配體與受體相互作用機制的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。許多學(xué)者[5]研究了RGD與生物材料的不同結(jié)合對細胞在粘附、增殖、遷徙等方面的影響，顯示RGD與材料表面的穩(wěn)定的連接是促進細胞粘附、增殖的關(guān)鍵。

ALP是參與骨等硬組織形成﹑代謝﹑再生的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，它通過水解磷酸脂﹑ATP及焦磷酸鹽，能去除鈣化抑制物，提供能量，促進鈣化[6]。同時ALP也是細胞分化活躍和具有成骨能力的標志之一[7]。而牙周膜細胞具骨母樣細胞特性，ALP也是牙周膜細胞分化和向成骨樣細胞轉(zhuǎn)化的先決條件。本實驗中，RGDS在濃度25mg/L即可提高牙周膜細胞ALP水平，這可能是RGDS通過激活整合素受體蛋白，引起胞內(nèi)細胞骨架改變，從而促進細胞貼壁、伸展，進而促進細胞增殖，使其分化提前，因此ALP水平的提高極可能是由于牙周膜細胞數(shù)量增加引起，但無論什么原因，RGDS這種促增殖與分化的作用在牙周組織修復(fù)過程中具有重要意義。

牙周組織再生的一個中心環(huán)節(jié)是牙槽骨和牙骨質(zhì)的重建及功能性牙周膜的完全再生，即形成牙周新附著，而PDL細胞作為具有異質(zhì)性的多能干細胞，其在根面上的黏附、生長、分化是形成新附著的關(guān)鍵。本實驗結(jié)果證實RGDS可有效促進PDL的黏附、伸展、增殖和分化。已有學(xué)者將含有RGD的七肽固定于I型膠原材料，PDL粘附率明顯提高[8]。因而如果將RGD應(yīng)用于引導(dǎo)牙周組織再生的過程中，則有可能促進PDL細胞在根面上黏附、伸展，激活PDL細胞成骨功能，促進牙周組織再生，這對體內(nèi)應(yīng)用RGDS促進牙周新附著的形成有一定的指導(dǎo)意義。

[參考文獻]

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