斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)正畸大鼠三叉神經(jīng)節(jié)PPTAmRNA的變化

[摘要]目的：觀察正畸牙齒移動(dòng)不同時(shí)期大鼠三叉神經(jīng)節(jié)（Trigeminal Ganglion ，TG）中前速激肽原A（PPTA）mRNA的表達(dá)變化，初步探討牙齒移動(dòng)導(dǎo)致疼痛的可能機(jī)制。方法：采用斑點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)正畸加力后不同時(shí)期大鼠TG內(nèi)PPTAmRNA水平的變化情況。結(jié)果：加力2h大鼠三叉神經(jīng)節(jié)PPTA mRNA的表達(dá)量開始增加，加力8h至加力3天達(dá)到最高，至第7天 PPTA mRNA水平仍然明顯高于對(duì)照組。結(jié)論：正畸牙齒移動(dòng)能導(dǎo)致TG內(nèi)PPTAmRNA表達(dá)水平的上調(diào)，提示PPTA可能參與了正畸疼痛的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]P物質(zhì)；前速激肽原A（PPTA）；牙齒移動(dòng)；正畸疼痛；三叉神經(jīng)節(jié)（TG）；斑點(diǎn)雜交

[中圖分類號(hào)]R332 R783.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）01-0067-02

Changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during Tooth Movement using Dot-blot hybridization method

YIN Yue，SUN Ying-ming

（1.Anhui Medical University，School of Stomatology，Hefei 230032，Anhui，China； 2.Department of People's Liberation Army 101 Hospital Dental，Wuxi 214044，Jiangsu，China）

Abstract： Objectives To investigate the changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during Tooth Movement. Methods The changes in the expression of PPTA mRNA in the rat trigeminal ganglion，during tooth movement in different periods，were detected using Dot-blot hybridization. Results The expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion was stonger than that in blank group and control group at all the time points； PPTA mRNA level was increased after 2 hours and reached the peak level around 8 hours to 3 days during tooth movement，7days after tooth movement PPTA mRNA level was still higher than in control group. Conclusion Orthodontic tooth movement can lead to a stonger expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion， suggesting that the PPTA may be involved in the occurrence of orthodontic pain.

Key words：substance P；PPTA；tooth movement；orthodontic pain；trigeminal ganglion；Dot-blot hybridization

疼痛是正畸治療中的一個(gè)常見反應(yīng)[1]。正畸治療中牙齒疼痛與不適主要來源于牙周組織在改建時(shí)釋放的疼痛介質(zhì)，是一個(gè)復(fù)雜的綜合性生理過程。而P物質(zhì)（Substance P，SP）是發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽，目前已證實(shí)SP參與痛覺的傳遞[2]。牙齒及牙周組織中的SP是由三叉神經(jīng)節(jié)（Trigeminal Ganglion ，TG）合成，PPTA是編碼SP的前體。在牙齒移動(dòng)中，三叉神經(jīng)節(jié)SP陽性神經(jīng)元可能發(fā)生相應(yīng)的改變。我們采用斑點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)正畸牙齒移動(dòng)不同時(shí)期大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)PPTAmRNA表達(dá)水平的變化，探討正畸牙齒移動(dòng)導(dǎo)致疼痛的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組、動(dòng)物模型制備和取材：SD雄性大鼠，體重（180±20）g（7～9）周。加力裝置采用結(jié)扎絲將一根鎳鈦螺旋拉簧一端扎在上頜第一磨牙上，另一端結(jié)扎在上頜中切牙上，并用自凝塑料加固結(jié)扎絲與牙連接處。加力力值為50g，使磨牙向近中移動(dòng)。大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（安置裝置加力）、對(duì)照組（安置裝置不加力）。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組根據(jù)不同時(shí)間分為以下亞組：2h組，8h組，1天組，3天組，7天組。每組5只大鼠，共50只大鼠。待大鼠達(dá)到規(guī)定時(shí)間點(diǎn)后，將動(dòng)物乙醚吸入麻醉后迅速斷頭取三叉神經(jīng)節(jié)，放入液氮中速凍。

1.2 組織總RNA的提取：采用異硫氫酸胍一步法提取大鼠三叉神經(jīng)節(jié)總RNA。RNA純度260/280比值>1.9。

1.3 斑點(diǎn)雜交（Dot blotting）檢測(cè)：取總RNA加等體積的RNA變性液65℃變性30min。取10μg變性RNA點(diǎn)于尼龍膜，室溫靜止20min，按照1.5J/cm2 254nm波長(zhǎng)紫外線照射1.8min待用。實(shí)驗(yàn)用探針序列與大鼠腦內(nèi)PPTAmRNA的第175號(hào)堿基到第204號(hào)堿基互補(bǔ)（5′-gatga tctaa attat tggtc cgact ggtcc -3′）。將尼龍膜和預(yù)雜交液封于雜交袋中，42℃預(yù)雜交16h，將標(biāo)記探針2μg加入雜交袋中，42℃，12h。洗膜后探針檢測(cè)采用酶標(biāo)抗地高辛抗體（過氧化物酶系統(tǒng)），DAB顯色。掃描儀掃描，計(jì)算個(gè)樣本灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，組組之間采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

斑點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)各對(duì)照組之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異；在正畸牙齒移動(dòng)過程中大鼠三叉神經(jīng)節(jié)PPTA mRNA的表達(dá)發(fā)生了明顯的變化，并具有一定的規(guī)律性。加力2h大鼠三叉神經(jīng)節(jié)PPTA mRNA的表達(dá)量開始增加，加力8h至加力3天達(dá)到最高，至加力7天時(shí)PPTA mRNA水平仍然明顯高于對(duì)照組和空白組（P<0.05）。見圖1、表1。

3 討論

SP是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽，由11個(gè)氨基酸組成，是1931年Von Euler等在研究馬體內(nèi)乙酰膽堿時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種物質(zhì)。20世紀(jì)70年代分離純化了SP，進(jìn)而確定了其組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)SP也是牙髓組織中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)神經(jīng)肽[3]。三叉神經(jīng)節(jié)中存在SP陽性神經(jīng)元，并且主要位于中小神經(jīng)元內(nèi)[4]。三叉神經(jīng)節(jié)初級(jí)感覺神經(jīng)元是疼痛的起始部位。傳導(dǎo)口腔頜面部疼痛的初級(jí)感覺神經(jīng)元位于三叉神經(jīng)節(jié)。在牙齒移動(dòng)中三叉神經(jīng)節(jié)SP神經(jīng)元興奮，引起SP的釋放，一方面釋放至外周末梢參與疼痛的發(fā)生，另一方面向上至三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核（caudal spinal trigeminal nucleus，VC）傳遞痛覺信息。

SP是公認(rèn)的疼痛傳遞介質(zhì)，具有增強(qiáng)傷害性信息傳遞的功能。SP被認(rèn)為對(duì)疼痛信號(hào)的傳遞呈雙重作用，在傳人的神經(jīng)元中為興奮性介質(zhì)，但在高級(jí)中樞神經(jīng)及其調(diào)制中則降低疼痛的敏感度。Henry等[5]認(rèn)為，SP作為神經(jīng)遞質(zhì)在疼痛的感覺傳遞和鎮(zhèn)痛機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。在正畸治療的初期，SP可能是導(dǎo)致牙齒輕微疼痛和不適癥狀的原因之一：（1）SP可使牙髓內(nèi)局部血管擴(kuò)張、通透性增加，髓腔內(nèi)壓上升以至牙髓微循環(huán)障礙，導(dǎo)致C纖維興奮性增加，興奮閾值降低；（2）SP可以介導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性致痛物質(zhì)，間接引起C纖維興奮閾值降低[6]，如：①SP在C纖維支配的局部區(qū)域可引起血管擴(kuò)張，通透性增加，血管內(nèi)液體的深處可以激活緩激肽類物質(zhì)；②SP作用于肥大細(xì)胞可使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺等。SP的作用并不是孤立的，而是與神經(jīng)系統(tǒng)及其它遞質(zhì)相互作用、相互配合而發(fā)揮作用的。另一方面，神經(jīng)系統(tǒng)不同部位、不同程度的損傷，SP的含量也隨著發(fā)生變化，通過測(cè)定SP的動(dòng)態(tài)變化，可在一定程度上推測(cè)其功能的恢復(fù)情況。

本研究采用斑點(diǎn)雜交的方法觀察正畸牙齒移動(dòng)不同時(shí)期大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)PPTAmRNA水平的變化情況，從SP中樞合成和mRNA水平來揭示正畸疼痛的變化規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)加力2h后PPTAmRNA的表達(dá)量開始增加， 加力 8h至加力3天達(dá)到高峰，至加力7天后仍然明顯高于對(duì)照組和空白組。該結(jié)果與Norevall的外周SP神經(jīng)變化的發(fā)現(xiàn)相一致[7]。筆者發(fā)現(xiàn)大鼠正畸牙齒移動(dòng)過程中三叉神經(jīng)節(jié)PPTAmRNA的表達(dá)發(fā)生了明顯的變化，表達(dá)水平上調(diào)，并具有一定的規(guī)律性，說明牙齒移動(dòng)的刺激能增強(qiáng)PPTA在大鼠三叉神經(jīng)元的表達(dá)，表明牙齒移動(dòng)產(chǎn)生了疼痛反應(yīng)。SP經(jīng)軸漿運(yùn)輸?shù)竭_(dá)三叉神經(jīng)纖維外周端末梢并釋放到牙髓或牙周組織，參與牙齒移動(dòng)導(dǎo)致的疼痛反應(yīng)，SP也可能到達(dá)三叉神經(jīng)纖維的中樞端并向三叉神經(jīng)脊束核釋放，從而加強(qiáng)牙齒移動(dòng)引起的痛反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)[8]：牙周疼痛發(fā)生時(shí)間在正畸加力后1～12h不等，平均為4～5h，在24～48h疼痛達(dá)到最高峰，加力后72h疼痛程度才逐漸減輕。可以看出，實(shí)際臨床中患者的疼痛規(guī)律和本研究發(fā)現(xiàn)的TG中PPTAmRNA的變化規(guī)律呈一定的相關(guān)性。說明SP參與了正畸疼痛的發(fā)生，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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