蟾毒靈抗肝細胞癌作用及機制研究

[摘要] 肝細胞癌早期診治困難，手術切除率低，放化療療效差，蟾毒靈是蟾酥中抗腫瘤作用最強蟾毒配基，蟾毒靈對人正常細胞沒有作用，而對肝癌細胞具有明顯的殺傷，抑制肝癌細胞生長。本文從蟾毒靈抗肝細胞癌生長作用及其相關作用機制進行論述，說明蟾毒靈在肝細胞癌治療中重要意義和研究前景。

[關鍵詞] 肝細胞癌；蟾毒靈；治療；機制

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）01-60-03

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡稱肝癌，在我國是常見的惡性腫瘤之一，死亡率在惡性腫瘤中居第3位，僅次于胃癌和食管癌，每年有600 000死于肝癌，嚴重威脅人類健康[1]。目前原發性肝癌的治療首選手術切除，我國原發性肝癌患者常伴有不同程度的肝硬變，發生率為70%～90%，在肝硬變基礎上切除腫瘤手術風險相當大，由于硬變的肝臟對缺血和失血極為敏感，長時間的入肝血流阻斷和大量失血，極易導致術后急性肝功能衰竭，手術切除率為15%～20%[2-3]。Ziser等[4]發現肝硬變患者接受各種手術治療，其圍手術期（術后30 d內）并發癥發生率為30.1%，死亡率為11.6%。肝癌全身靜脈化療療效差，肝癌局部化療（如肝動脈、門靜脈置管介入化療）面臨著肝癌細胞多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）的問題，MDR是肝癌化療失敗的重要原因[5-6]。因此研制和開發新型抗肝癌藥物是提高肝癌治療療效，延長患者生存期的關鍵所在。

蟾毒靈（bufalin）來源于兩棲綱蟾蜍科動物中華大蟾蜍、黑眶蟾蜍或花背蟾蜍等的耳后腺及背部皮膚腺分泌的白色漿液，是從中藥蟾酥中提取的蟾毒配基之一，屬于細胞拓撲異構酶Ⅱ抑制劑，疏水性較強。蟾蜍毒素具有強烈毒性，以毒攻毒之功效，蟾毒靈是蟾酥中抗腫瘤作用最強蟾毒配基，蟾毒靈對人正常細胞沒有作用，而對肝癌細胞具有明顯的殺傷，抑制肝癌細胞生長，細胞周期阻滯及促凋亡作用[7]。本文結合相關文獻，針對蟾毒靈在肝癌治療中作用及其機制加以論述。

1 蟾毒靈抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡

拓撲異構酶Ⅱ（topoisomeraseII，topoⅡ）是調節生物體雙鏈DNA超螺旋解旋及重新聚合狀態的相互切換的關鍵酶，廣泛存在于生物體，與DNA復制以及染色體的凝集關系非常密切。Hashmioto等[8]發現蟾毒靈可引起TopoⅡ-a mRNA的下降導致TopoⅡ-a數量和活性的下降，且這種現象早于凋亡特征之一，DNA斷裂的發生。Watabe等[9]發現酪蛋白激酶2在蟾毒靈的作用下從胞漿移位到細胞核內，與TopoⅡα形成復合物后調節該酶的活性，使拓撲異構酶Ⅱ活性下降，表明蟾毒靈誘導細胞凋亡可能是通過抑制TopoⅡ活性來實現的。蘇永華等[10]將蟾毒靈作用于SMMC-7721和BEL-7402細胞后錐蟲藍染色發現不同濃度蟾毒靈對人肝癌細胞細胞膜具有破壞作用。顧偉等[11]研究蟾毒靈對BEL-7402肝癌細胞生長抑制作用呈濃度-時間依賴性，將細胞周期阻滯于G2/M期，電鏡觀察到典型的細胞凋亡特征。Bcl-2基因對細胞凋亡具有關鍵性調節作用，其表達蛋白位于核膜、粗面內質網和線粒體膜上，是一種對細胞凋亡具有明顯抑制作用的癌基因[12]。Kawazoe等[13]通過研究蟾毒靈對腫瘤細胞膜點位的影響及其與Bcl-2關系后發現其對Na+-K+-ATP酶的抑制作用于Bcl-2蛋白的上游，通過減少Bcl-2蛋白表達而起到誘導凋亡作用。Qi等[14]在研究中發現蟾毒靈在使肝癌細胞凋亡過程中，不僅可以使Δψm下降，細胞色素c釋放、caspase-9、caspase -3激活 及PARP從116 kDa 裂解到89 kDa增加，而且發現Fas蛋白及caspase-8、caspase-10激活增加。使用caspase抑制劑后發現蟾毒靈的促凋亡作用可以被阻斷，特別是當caspase-10被抑制后阻斷凋亡作用明顯。提示蟾毒靈致肝癌細胞凋亡的作用與Fas蛋白介導的caspase-8/-10依賴的途徑有關，而且其中FAS介導的caspase-10依賴途徑可能起到更關鍵的作用。JNK MAPK信號傳導通路參與許多細胞凋亡的發生 ，活化的JNK主要通過影響相關基因表達和線粒體的功能介導細胞凋亡，張寧等[15]實驗發現蟾毒靈可以通過增加JNK1/2的磷酸化水平而激活JNK MAPK信號傳導通路，使肝癌細胞凋亡，其機制可能是磷酸化反應激活的JNK從胞漿移位至細胞核內，通過轉錄因子c-Jun，ATF-2，ELK-1等的磷酸化促進相應基因的表達及新蛋白質的合成，促進及引起細胞凋亡。Rel/NF-κB家族是一種重要的核轉錄激活因子，參眾多基因轉錄調控，與腫瘤細胞的耐藥和抗凋亡作用密切相關[16]。韓克起等[17]采用[γ32-P]ATP 標記特異性 NF-κB 寡核苷酸探針用 EMSA 法檢測不同濃度蟾毒靈處理BEL-7402 細胞核提取物中的活性變化發現24 h后NF-κB 輕度活化，48 h后時明顯活化，有時間依賴性，提示在蟾毒靈誘導肝癌細胞凋亡過程中，NF-κB可能具有促進凋亡作用，或者雖有抑制凋亡作用，但抑制凋亡的作用弱于蟾毒靈促進凋亡作用。顧偉等[18]通過建立裸鼠人肝癌原位移植瘤模型，體內分別應用蟾毒靈高（1.5 mg/kg）、中（1 mg/kg）、低（0.5 mg/kg）劑量、阿霉素8 mg/kg，結果發現蟾毒靈使腫瘤體積明顯縮小，病理檢查高、中劑量組癌灶內有大量纖維結締組織增生，肝癌組織以中重度壞死為主，壞死灶主要集中在腫瘤中央部位。電鏡觀察到肝癌細胞出現細胞核固縮，胞漿濃縮，染色質濃集于核膜內側呈團塊或新月狀，胞漿起泡和凋亡小體，并見凋亡小體脫離細胞體，沒入間質或被其他細胞吞飲。蟾毒靈低、中、高劑量組腫瘤細胞凋亡指數分別明顯高于阿霉素組，且高劑量蟾毒靈抑瘤率顯著高于阿霉素，顯著延長荷瘤裸鼠平均生存期。

2 蟾毒靈逆轉肝癌細胞多藥耐藥

肝癌是臨床常見的對化療不敏感的惡性腫瘤，研究證實MDR現象是肝癌化療無效或漸失效的主要原因。顧偉等[18]用誘導法建立BEL7402/5-Fu耐藥細胞株，將0.005、0.001、0.000 2μmol/L 3個濃度的蟾毒靈作為逆轉劑對肝癌細胞MDR的逆轉作用進行了研究，發現三個濃度的蟾毒靈作用72 h均顯示出一定的逆轉耐藥作用，其中0.005μmol/L的蟾毒靈的逆轉效應強于1μmol/L的傳統用于逆轉耐藥的鈣通道阻滯劑維拉帕米，其逆轉作用是維拉帕米的1.66倍。為了研究奇逆轉耐藥的機制，用多藥耐藥相關蛋白（multi-drug resistance associated porotein，MRP）的底物熒光素對BEL7402/5-Fu耐藥細胞株研究后認為蟾毒靈可能對BEL7402/5-Fu耐藥細胞具有雙相作用，誘導細胞凋亡濃度（>0.01μmo/lL）的蟾毒靈可通過激活P38MAPK繼而上調MRP1的表達促進腫瘤細胞耐藥，在低細胞毒濃度（0.001μmol/L）蟾毒靈則可能通過其他途徑下調MRP1的表達而逆轉耐藥。研究發現導致其耐藥機制包括多個方面，包括藥物轉運泵MRP1參介導的藥物外排，Bcl-xL的高表達改變了的細胞凋亡Bcl-xl/Bax的比值，肝癌組織中胸苷酸合酶表達增加，耐藥細胞株中E-鈣黏合素表達增加使細胞間黏附增加有關。孟曉燕等[19]用蟾毒靈誘導耐藥Bel-7402肝癌細胞凋亡，且呈濃度依賴性；在BUF 0.01～1.00μmol/L范圍內，隨藥物作用濃度升高，細胞凋亡率顯著升高。BUF通過阻滯肝癌細胞周期進程、誘導細胞凋亡，逆轉人肝癌MDR細胞株BEL-7402/5-FU的抑制作用，人肝癌MDR細胞株BEL-7402/5-FU對BUF沒有耐藥性，表明BUF能夠逆轉耐5-FU藥物的肝癌細胞MDR。

3 蟾毒靈抑制肝癌血管新生

腫瘤的生長、侵襲均離不開血管的新生，血管內皮細胞的增值是血管新生中非常重要的環節。肝癌血供豐富，是一個高度血管化的惡性腫瘤，其生長和代謝需要持續的血管生成，肝癌的血管新生化與其生物學特性包括高度血管浸潤及轉移傾向，并導致該疾病的預后不良[20]。蟾毒靈不但對腫瘤細胞的生長具有抑制作用，對血管內皮細胞的生長也具有明顯抑制作用。Lee等[21]用5、10、20 nM的蟾毒靈分別作用于牛大動脈內皮細胞5 d后發現牛大動脈內皮細胞的生長分別被抑制了45.3%、62.8%、和75.6%。實驗同時發現，蟾毒靈對臍靜脈內皮細胞也有同樣的抑制作用。實驗發現蟾毒靈可以使G0/G1和S期內皮細胞減少，而阻滯在G2/M期細胞增加。翟笑楓等[22]采用MTT法測定蟾毒靈對人臍靜脈內皮細胞ECV304生長作用時發現蟾毒靈對ECV304細胞的生長有抑制作用，且呈濃度和時間的依賴性。24、48、72 h 的IC50分別為 1.104、0.355、0.090 5μg/mL，蟾毒靈具有明確的抑制血管內皮細胞增殖和抗血管生成的作用。

4 蟾毒靈抗肝癌存在問題與展望

近年來多激酶靶向抑制劑如索拉菲尼已被推薦為治療晚期肝癌的一線用藥，收到了較好的治療效果[23-24]。與索拉菲尼相比，Gao等[25]研究發現蟾毒靈對肝癌細胞生長抑制作用強于索拉菲尼，索拉菲尼抑制肝癌細胞的生長具有劑量依賴性，肝癌細胞HepG2的IC50為3565.7nmol/L，蟾毒靈對HepG2肝癌細胞的IC50為157.87 nmol/L。蟾毒靈口服吸收后與人血漿蛋白結合率約為97% ， 屬于高血漿蛋白結合，只有少部分游離藥物作為活性藥物分子參與體內藥理效應。因蟾毒靈對心血管系統具有類似洋地黃樣強心作用，高于10-7 mol/L的濃度對心血管系統具有毒副作用，限制了臨床高劑量應用[26-27]。蟾毒靈具有廣譜的抗癌作用，但其心臟毒性、猝死、低水溶性等缺點，限制了蟾毒靈的臨床應用[28-30]。隨著物理學、化學、材料學等相關學科的發展，納米技術被越來越多的用到藥物治療上，納米載體的應用不僅能夠提高藥物生物可利用度，而且改進藥物的時間控制釋放性能和藥物靶向精確定位釋藥，從而降低藥物全身毒副作用，相信不久的將來，隨著蟾毒靈新劑型不斷問世，將造福于廣大肝癌患者。

[參考文獻]

[1] Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002[J].CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74-108.

[2] 吳孟超，陳漢，張曉華，等.外科治療原發性肝癌1102例[J].第二軍醫大學學報，1993（3）：201-202.

[3] Belghiti J，Hiramatsu K，Benoist S，et al.Seven hundred and forty-seven hepatectomied in the 1990s：an up-date to evaluate the actual risks of liver resection[J].J Am Coll Surg，2000，191（1）：38-46.

[4] Ziser A，Plevak DJ，Wiesner RH，et al.Morbidity and mortality in cirrhotic patients undergoing anesthesia and surgery[J].Anesthsiology，1999，90（1）：42-53.

[5] Huang M，Liu G.The study of innate drug resistance of human hepatocellular carcinoma Bel7402 cell line[J].Cancer Letters，1999，135（1）：97-105.

[6] Henry SH，Bosch FX，Bowers JC.Aflatoxin，hepatitis and worldwide liver cancer risks[J].Adv Exp Med Biol，2002，504（2）：229-233.

[7] Jing Y，Ohizumi H，Kawazoe N，et al.Selective inhibitory effect of bufalin on growth of human tumor cells in vitro：association with the induction of apoptosis in leukemia HL 60 cells[J].Jpn J Cancer Res，1994，85（6）：645-651.

[8] Hashmioto S，Jing Y，Kawazoe N，et al.Bufalin reduces the level of topoisomeraseⅡ in human leukemia cells and affects the cytotoxicity of anticancer drugs[J].Leuk Res，1997，21（9）：875-883.

[9] Watabe M，Nakajo S，Yoshida T，et al.Treatment of U937 cells with bufalininduces the translocation of casein kinase 2 and modulates the activity of topoisomeraseII prior to the induction of apoptosis[J].Cell Growth Differ，1997，8（8）：871-879.

[10] 蘇永華，尹西才，謝覺民，等.三種蟾毒單體對SMMC-7721和BEL-7402人肝癌細胞生長的抑制作用[J].第二軍醫大學學報，2003，24（4）：393-395.

[11] 顧 偉，韓克起，蘇永華，等.蟾毒靈對人肝癌BEL-7402細胞增殖的影響[J].中西醫結合肝病雜志，2006，16（1）：16-20.

[12] Mazars A，Geneste O，Hickman J.The Bcl-2 family of proteins as drug targets[J].J Soc Biol，2005，199（3）：253-65.

[13] Kawazoe N，Aiuchi T，Masuda Y，et al.Induction of apoptosis by bufalin in human tumor cells is associated with a change of intracellular concentration of Na+ions[J].J Biochem，1999，126（2）：278-286.

[14] Qi F，Inagaki Y，Gao B，et al.Bufalin and cinobufagin induce apoptosis of humanhepatocellular carcinoma cells via Fas-and mitochondria-mediated pathways[J].Cancer Sci，2011，102（5）：951-958.

[15] 張寧，汪晨，顧偉，等.蟾毒靈誘導人肝癌細胞HepG2凋亡的作用及機制[J].中西醫結合肝病雜志，2009，19（6）：343-345.

[16] Van Antwerp DJ，Martin SJ，Kafri T，et al.Suppression of TNF-alpha-induced apoptosis by NF-kappa B[J].Science，1996，274（5288）：787-789.

[17] 韓克起.蟾毒靈誘導肝癌細胞凋亡及相關機理研究[D].上海：上海第二軍醫大學，2006：73-74.

[18] 顧偉，韓克起，蘇永華，等.蟾毒靈對裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用及對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響[J].中西醫結合學報，2007，5（2）：155-159.

[19] 孟曉燕，方凡夫，顧偉.蟾毒靈對人肝癌多藥耐藥BEL-7402/5-FU細胞增殖活性的影響[J].山東醫藥，2009，49（5）：37-39.

[20] 李惠，葉慶，殷曉進，等.肝細胞肝癌血管新乍的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志，2009，14（4）：369-372.

[21] Lee DY，Yasuda M，Yamamoto T，et al.Bufalin inhibits endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro[J].Life Sciences，1997，60（20）：127-134.

[22] 翟笑楓，呂祥，顧偉，等.蟾毒靈抑制血管生成作用的初步觀察[J].中國中醫藥信息雜志，2010，17（8）：29-31.

[23] Llovet JM，Ricci S，Mazzaferro V，et al.Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma[J].N Engl J Med，2008，359（4）：378-390.

[24] Cheng AL，Kang YK，Chen Z， et al.Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma：a phase III randomised，double-blind，placebo-controlled trial[J].Lancet Oncol，2009，10（1）：25-34.

[25] Gao Y，Li HX，Xu LT，et al.Bufalin enhances the anti-proliferative effect of sorafenib on human hepatocellular carcinoma cells through downregulation of ERK[J].Molecular Biology Reports，2012，39（2）：1683-1689.

[26] 劉穎，陳志強，陶蓓蕾，等.蟾毒靈血漿蛋白結合率的測定[J].中國醫藥雜志，2009，34（21）：2817-2820.

[27] Toma S，Hirai Y，Sugimoto C，et al.Metabolic fate of buaflin in rats[J].Yakugaku Zasshi，1991，111（11）：676-686.

[28] Bick RJ，Poindexter BJ，Sweney RR，et al.Effects of Chan Su，a traditional Chinese medicine，on the calcium transients of isolatedcardiomyocytes： cardiotoxicity due to more than Na， K-ATPase blocking[J].Life Sci，2002，72（6）：699-709.

[29] Liu PF，Zhu MJ，Li YG，et al.The research oncytotoxicity and cellular uptake of mPEG-PLGA-PLL nanoparticles. Proceedings of 2009 international conference on advanced fibers and polymer materials[J].2009，1-2：1190-1192.

[30] Kostakis C，Byard RW.Sudden death associated with intravenous injection of toad extract[J].Forensic Sci Int，2009，188（1-3）：e1-e5.

（收稿日期：2012-12-06）