枸杞多糖對2型糖尿病大鼠胰腺β細胞PDX—1基因表達的實驗研究

[摘要] 目的 探討枸杞多糖對2型糖尿病大鼠β細胞分泌功能及PDX-1基因mRNA表達的影響。 方法 用高糖飼喂并結合鏈脲佐菌素誘導制備2型糖尿病大鼠模型，分組灌胃給予不同濃度的枸杞多糖及對照藥物， 50只實驗動物隨機分為5組：對照組、模型組、模型+30 mg/kg LBP組、模型+60 mg/kg LBP組、模型+ 90 mg/kg LBP組。連續8周后檢測空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清胰島素，處死大鼠取胰腺組織，RT-PCR檢測β細胞內PDX-l及胰島素mRNA的表達水平。 結果 2型糖尿病大鼠胰腺β細胞PDX-l及胰島素mRNA的表達水平顯著下降（P<0.01）；60 mg/kg和90 mg/kg LBP組能顯著上調2型糖尿病大鼠胰腺β細胞PDX-l與胰島素mRNA表達水平（P<0.05）。 結論 LBP可以通過上調PDX-l和胰島素mRNA表達，改善2型糖尿病大鼠β細胞胰島素合成和分泌功能的損傷。

[關鍵詞] 枸杞多糖；2型糖尿病；β細胞；PDX-1

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）01-34-04

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一個復合病因的綜合病癥，是由于體內胰島素缺乏或拮抗胰島素的激素增加，或胰島素在靶細胞內不能發揮正常生理作用而引起的葡萄糖、蛋白質及脂質代謝紊亂的一種綜合征，長期高血糖、高血脂導致β細胞功能衰退、胰島素分泌缺陷的發生，是糖尿病的重要特征[1]。2型糖尿病病因極為復雜，發病機制目前尚未完全清楚，大量研究表明胰島素抵抗和胰島素的分泌缺陷是其發病的中心環節[2]。所以尋求既可以降糖，同時又能保護β細胞，阻止其損傷與功能衰退，增加胰島素分泌的有效藥物是糖尿病治療的關鍵。

枸杞為茄科植物寧夏枸杞（Lycuim barbarum L.）干燥的成熟果實，是一味傳統常用的中藥，其中主要有效成分為枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）[3]。大量藥理及臨床研究表明，LBP是一種良好的免疫調節劑，它能多途徑、多層面調節機體的免疫系統。LBP具有多種生物活性，具有抗衰老[4-5]、抗應激[6]、抗腫瘤[7-8]、保肝[9]、降血脂[10]、雙向調節血糖[11-12]等功用，對機體毒副作用小，具有廣闊的開發前景。

胰島β細胞的凋亡是2型糖尿病重要的發病機制，PDX-1（pancreatic duodenal homeobox-1）是胰島素基因轉錄的主要調節因子，在調節胰腺發育、分化起著重要的作用。它參與了一系列與維持β細胞特性和功能有關的基因的轉錄調控[13]。本研究以高糖誘導的2型糖尿病大鼠為研究對象，觀察LBP對高糖誘導的胰腺β細胞胰島素的分泌情況及PDX-1 mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠50只，約2月齡，體重（200±20） g，由南昌大學醫學院動物中心提供，在動物中心SPF級動物房喂養。

1.2 藥物與試劑

LBP瓶裝干粉購自浙江方格藥業有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma公司）；檸檬酸（Sigma公司）；胰島素及胰高糖素檢測試劑盒購自天津九鼎醫學生物工程有限公司；即用型PCR擴增試劑盒購自Fermentas公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.3 糖尿病動物模型的建立

參照文獻方法[15]稍作修改。SPF級雄性SD大鼠適應性飼養1周后，隨機抽取8只作為正常對照組，其余大鼠用高糖高脂飼料（飼料自制，組成為：10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鈉，66.5%常規飼料）喂養30 d。鼠空腹12 h以上，鏈脲佐菌素溶于過濾除菌的0.05 mmol/L，pH=4.5的檸檬酸緩沖液。將STZ按照190 mg/kg體重劑量以腹腔注射（i.p.）的方式在5 min內注射完畢，72 h后剪尾采血檢測血糖，以血糖>16.7 mmol/L為成功模型納入實驗。

1.4 實驗分組與給藥

將造模成功的40只大鼠按血糖值、體重隨機分為4組：模型對照組（水灌胃）及LBP高、中、低劑量組（90、60、30 mg/kg LBP灌胃）。定期稱量體重調整給藥量，1次/d，連續8周。

1.5 動物處理

給藥結束后，將大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）進行麻醉，股動脈取血分離血清，用于血生化指標檢測。在胰頭部位剪取適量胰腺組織于-80℃保存，用于檢測PDX-1及胰島素mRNA表達水平。

1.6 血生化指標測定

空腹血糖（FBG）、三酰甘油（triglyeride，TG），總膽固醇（total cholesterol，TC），高密度脂蛋白（hish density lipoprotein，HDL），低密度脂蛋白（10w density lipoprotein，LDL）由HITACH717全自動生化分析儀測定。空腹胰高血糖素（fasting plasma glucagon，FPG）和FSI水平按照試劑盒要求檢測。

1.7 RT-PCR檢測

胰腺總RNA抽取采用TRizol一步法，按試劑盒要求操作，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PDX-1的引物序列：上游引物5’-GCGAGGAGCTGCTGGCATTG-3’，下游引物5’-CCAACTGGCTCTTGTGCCCCC-3’；胰島素的引物序列：上游引物5’-ACACACCCAAGTCCCGTCGTG-3’，下游引物5’-GGGGAGTGGTGGACTCAGTTGC-3’；GADPH的引物序列：上游引物5’-ACCCGCCACCAGTTCGCCAT-3’，下游引物5’-TGACCCCGTCTCCGGAGTCCAT-3’，于美國生物醫學中心基因庫（GeneBank）中檢索設計。循環步驟如下：94℃預變性5 min，（94℃變性30 s，退火：PDX-1 55℃，胰島素58℃；GADPH 57℃，35 s，72℃延伸35s）×35次循環，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，EB染色，分子質量標準為DNA maker DL2000，凝膠圖像分析系統對RT-PCR產物電泳條帶進行密度分析，以GAPDH為內參，計算PDX-1和胰島素基因的相對表達量。

1.8 統計學處理

統計學方法實驗數據均用SPSS13.0軟件進行統計學處理，各項指標結果以（）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LBP對PDX-1和胰島素mRNA表達的影響

PDX-1和胰島素基因在2型糖尿病模型大鼠胰腺組織中的表達量顯著降低（P<0.01），60 mg/kg與90 mg/kg LBP組PDX-l mRNA表達較模型組有明顯上升（P<0.01），60 mg/kg LBP組胰島素mRNA的表達上升最顯著（P<0.01）。見圖1。30 mg/kg LBP組與模型組比較，PDX-1和胰島素mRNA表達的增加差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 LBP對大鼠血生化指標的影響

糖尿病模型組空腹血糖與胰島素水平均較對照組有明顯升高（P<0.05或P<0.01）；不同濃度LBP組與糖尿病模型組比較，空腹血糖水平顯著下降（均P<0.05），但與對照組比較，差異無統計學意義（P<0.05）；不同濃度LBP組胰島素水平較糖尿病模型組也顯著下降（P<0.05或P<0.01）。見表1。

3 討論

隨著人們生活方式的改變，尤其是高能量食品的攝入過多及體力活動減少，糖尿病的發病率大幅上升，嚴重危害到人們身體的健康[16]，其中以2型糖尿病患者居多。據WHO報告，預計到2025年全球20～79歲糖尿病患者將達到3.33億人[17]。與西方人群相比，我國2型糖尿病患者發病更早，β細胞功能受損更早且更嚴重[18-19]，其增長速度遠遠超過發達國家。

PDX-l是調控胰島素基因轉錄、胰島素顆粒成熟和分泌的重要轉錄因子[20]，它通過結合胰島素基因轉錄調控區A3而激活其轉錄過程，上調胰島素表達水平。此外，在胰島素mRNA轉錄水平不變的情況下，PDX-l的高表達能提高細胞間胰島素含量。因此，PDX-l決定著胰島素基因的啟動、表達和增強效應，同時也調控著胰島素的成熟和分泌過程-，在胰腺早期發育、較晚期β細胞的分化以及β細胞維持正常功能中起著重要作用[22-23]。

枸杞作為一味常用傳統中藥，臨床使用歷史已相當久遠。在倡導中藥現代化的今天，枸杞多糖作為枸杞的主要活性成分日益得到重視。許多研究表明，枸杞多糖是枸杞子調節免疫、延緩衰老的主要活性成分，并具有降血脂[24]、抗脂肪肝[25]、抗衰老等作用。近年來有學者研究發現，枸杞多糖還具有降糖[26]、降脂、改善胰島素抵抗[27]等作用，提示枸杞多糖對糖尿病具有一定的防治作用。本研究結果顯示，LBP可以通過上調PDX-l和胰島素mRNA表達，改善2型糖尿病大鼠β細胞合成和分泌胰島素的功能，保護β細胞的功能。枸杞多糖既有豐富的生物學活性，又無毒副作用，無論在臨床運用還是保健類食品開發方面都有著廣闊的前景，所以對枸杞多糖的深入研究的開發具有十分重要的意義。

[參考文獻]

[1] Wild S，Roglie G，Green A， et a1.Global prevalence of diabetes：estimates for the year 2000 and projections for 2030[J].Diabetes Care，2004，27：1047-1053.

[2] Kahn SE，Hull RL，Utzsehneider KM.Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes[J]. Nature，2006，444：840-846.

[3] Chen W.Progress of Studie s on the Pharmacology Effect of Lycium Barbarum polysaccharides[J]. Strait Pharmaceutical Journal，2005，17（4）：4-7.

[4] Yu MS，Lai CS，Ho YS，et al.Characterization of the effects of anti-aging medicine Fructus lycii on beta-amyloid peptide neurotoxicity[J].Int J Mol Med，2007，20（2）：261-268.

[5] Li XM.Protective effect of Lycium barbarum polysaccharides on streptozotocin-induced oxidative stress in rats[J].Int J Biol Macromol，2007，40（5）：461-465.

[6] Gong H，Shen P，Jin L，et al.Therapeutic effects of Lycium barbarum polysaccharide（LBP）on irradiation or chemotherapy-induced myelosuppressive mice[J].Cancer Biother Radiopharm，2005，20（2）：155-162.

[7] Zhang M，Chen H，Huang J，et al.Effect of lycium barbarum polysaccharide on human hepatoma QGY7703 cells： inhibition of proliferation and induction of apoptosis[J].Life Sci，2005，76（18）：2115-2124.

[8] Chao JC，Chiang SW，Wang CC，et al.Hot water-extracted Lycium barbarum and Rehmannia glutinosa inhibit proliferation and induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells[J].World J Gastroenterol，2006，12（28）：4478-4484.

[9] Ha KT，Yoon SJ，Choi DY，et al.Protective effect of Lycium chinense fruit on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity[J].J Ethnopharmacol，2005，96（3）：529-535.

[10] 朱彩平，張聲華.枸杞多糖對高脂血癥小鼠血脂及脂質過氧化的影響[J].營養學報，2005，27（1）：79-80.

[11] Luo Q，Cai Y，Yan J，et al.Hypoglycemic and hypolipidemic effects and antioxidant activity of fruit extracts from Lycium barbarum[J].Life Sci，2004，76（2）：5137-5149.

[12] Kawamori R，Eliaschewitz FG，Takayamia H，et al.Efficacy of insulin glargine and glimepiride in controlling blood glucose of ethric Japanese patients with type 2 diabetes mellitus[J].Diabetes Res Chin Pract，2008，79：97-102.

[13] Mckinnon CM，Docherty K.Pancreat?c duodenal homeobox-1，PDX-1，a major regulator of beta cell dentity and function[J].Diabetologia，2001，44（10）：1203-1214.

[14] 田麗梅，王浩.枸杞多糖的提取分離和其組成研究[J].中國中藥雜志，2006，31（19）：1603-1607.

[15] Qiang Zhua，Haiyan Changa，Yan Chena，et al.Protection of inactivated influenza virus vaccine against lethal influenza virus infection in diabetic mice[J]. Biochem Biophys Res Commun，2005，329（1）：87-94.

[16] 周多奇，龔莉.糖尿病運動療法及其機理[J].安慶師范學院報，2006，12（ 3）：107-109.

[17] Sicree R，Shaw JE，Zimet PZ.The global burden of diabetes Inbrussels[J].Internatlenal Diabetes Federation，2003（71）：15-71.

[18] 中國胰島素分泌課題研究協作組，安雅莉，李光偉.中國新診斷圓型糖尿病患者胰島素分泌和胰島素抵抗特點調查[J].中華內分泌代謝雜志，2007，23（5）：附錄5a1-3.

[19] 周密，周健，陸俊茜，等.新診斷的2型糖尿病患者血糖水平與胰島素分泌及胰島素抵抗的關系[J].診斷學理論與實踐，2009，8（3）：269-272.

[20] 陳長浩，傅學奇，鄭嘵飛.PDX-1基因與糖尿病治療[J].生命的化學，2004，24（1）：52-54.

[21] Sun Y，Chen L，Hou XG.Differentiation of bone mSITOW derived mesenehymal stem cells from diabetic patients into insulin preducing cells in vitro[J].Chin Med，2007，120（9）：77l-776.

[ 22 ] Alvarss on M，Sund kvist G，Lager I，et al.Effect of insulin vs. Glibenclamidein recently diagnosed patient with type 2 diabetes：A 4 year follow-up[J].Diabetes Obes，2008，10：421-429.

[23] Song B，scheuner D，Ron D，et a1.Chop deletion reduces oxidative stress，improves β cell function，and promotes cell survival in multiple mouse models of diabetes[J].The Journal of Clinical lnvestigation，2008，118 （10）：3 378-3 389.

[24] 劉萍，何蘭杰.枸杞多糖對糖尿病大鼠糖脂代謝的影響[J].寧夏醫學院報，2008，30（4）：427-428.

[25] 宋育林，曾民德，陸倫根，等.枸杞多糖對高脂飲食誘導的脂肪肝大鼠模型的影響[J].安徽醫藥，2007，11（3）：202-205.

[26] 田麗梅，王曼.單味中藥枸杞降血糖作用及對胰腺組織形態學影響的研究[J].中醫藥通報，2005，4（1）：48-51.

[27] 宗燦華，田麗梅.枸杞多糖對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及脂聯素基因表達的影響[J].中國康復理論與實踐，2008，14（6）：531-532.

（收稿日期：2012-11-26）