黃柏炮制過程中生物堿成分含量變化的研究

[摘要]目的 探究黃柏炮制過程中生物堿成分的量變和質變。 方法 采用高效液相色譜法測定黃柏不同炮制品，在不同溫度下生物堿含量的變化。 結果 黃柏經炮制之后，隨著溫度的增加，其原有的生物堿、小檗堿、黃柏堿含量降低，并會生成新的化學成分小檗紅堿，其含量隨著溫度的升高而增加。 結論 黃柏炮制過程中生物堿發生了量變與質變，加熱是關鍵的因素，可以促進黃柏生物堿的含量變化或轉化為新的化學物質。

[關鍵詞]黃柏；炮制；生物堿

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）01-43-03

黃柏為常用中藥，系蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.除去栓皮的干燥樹皮，黃柏藥性苦、寒，入腎、膀胱經，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡的療效[1]。黃柏中生物堿的有效成分中包含小檗堿、黃柏堿、巴馬汀、藥根堿等，其中鹽酸小檗堿具有抗菌、解熱和抗炎、降壓和降血脂等作用[2]；而小檗紅堿做為黃柏炮制后生成的新的化學成分，則具有滋陰的藥理活性[3]；黃柏堿則具有明確的降血壓的活性，同時也是合成降血壓藥的母核[4]。將上述3種成分進行不同溫度上的含量考察，并進行量變與質變的研究尚未見報道。炮制后其化學成分的變化將是解析炮制原理的重要環節，本研究重點探討黃柏炮制過程中指標性成分的含量變化，并以此對黃柏炮制的科學內涵進行初探。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津公司LC-10ATVP高效液相色譜儀，SPD-10AVP紫外檢測器，瑞士METTLER AE240型十萬分之一分析天平，北京永光DG-101型電熱鼓風干燥箱，KQ-250DB型數控超聲波清洗器（功率250 W，工作頻率40 KHz）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品購自中國藥品生物制品檢定所

（111692-200806）；小檗紅堿對照品為自制對照品，測定純度大于98%；鹽酸黃柏堿對照品購自成都曼思特生物技術有限公司，純度大于98%。乙腈、甲醇均為色譜醇，水為超純水，其它試劑均為分析純。黃酒（紹興市古泉釀酒廠，批號20060926，酒精度9%）。

1.3 藥材

黃柏藥材，購自四川省藥材公司，經遼寧中醫藥大學藥用植物教研室王冰教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。

2 方法與結果

2.1 炮制品制備

生黃柏烘干品：取凈制后黃柏，直接放入烘箱，分別在120、140、160、180、200℃下進行加溫處理15 min后，取出備用。

酒黃柏：根據中國藥典2010版一部，附錄ⅡD酒炙法制備。取凈黃柏，每份20 g，共5份（按每100 kg黃柏使用黃酒20 kg），拌勻，悶潤2 h后，分別置烘箱中，在120、140、160、180、200℃加熱處理15 min，備用。

鹽黃柏：根據中國藥典2010版一部，附錄ⅡD鹽炙法制備。取凈黃柏，每份20 g，共5份（按每100 kg黃柏使用鹽3 kg），拌勻，悶潤2 h后，分別置烘箱中，在120、140、160、180、200℃加熱處理15 min，備用。

2.2 供試品的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸小檗紅堿、鹽酸黃柏堿對照品適量，分別加甲醇制成鹽酸小檗堿0.101 2 mg/mL、鹽酸小檗紅堿9.56 g/mL、鹽酸黃柏堿0.113 2 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取2.1項下各樣品，粉碎，過四號篩，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加1%醋酸-甲醇溶液25 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 KHz）30 min，放涼，再稱定重量，用1%醋酸-甲醇補足失重，搖勻，取續濾液，即得。

2.3 方法學考查

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent-C18 （150 mm×4.6 mm，5 m）；流動相：以乙腈為流動相為A，以0.1%磷酸溶液（每100 mL流動相加十二烷基硫酸鈉0.2 g）為B，進行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min，檢測波長：284 nm；進樣量：10 L。供試品溶液色譜峰與對照品對應的吸收峰的理論塔板數均不低于6 000，對照品及供試品色譜圖見圖1。

2.3.2 線性范圍考察 分別精密吸取1、2、4、8、10、20μL溶液， 注入高效液相色譜儀，測定色譜峰面積。以峰面積Y對對照品濃度X分別進行線性回歸方程處理。經線性回歸，鹽酸小檗堿回歸方程為：Y= 2 344 013.8X-33 221.56，r=0.999 6，線性范圍為0.101 2～2.048 g；鹽酸小檗紅堿回歸方程為：Y=2 068 051.35X+39 007.79，r=0.999 1，線性范圍為0.009 56～0.191 2 g；鹽酸黃柏堿回歸方程為：Y=1 248 068X-5 646.25，r=0.999 9，線性范圍為0.113 2～2.264μg。

2.3.3 精密度試驗 分別精密吸取鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗紅堿對照品溶液10 L，連續進樣6次，按“2.3.1”項下條件測定各對照品的色譜峰面積，計算其RSD分別為1.2%，1.9%和1.3%。

2.3.4 穩定性實驗 取同一黃柏供試品，放置于室溫，于0、2、4、6、8、10、12、24 h后，按“2.3.1”項下操作，結果鹽酸小檗堿、鹽酸小檗紅堿、鹽酸黃柏堿的峰面積RSD分別為1.2%，2.3 %和1.6%，表明該供試品溶液室溫下在24 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗 取同一黃柏供試品6份，按“2.3.1”項下測定鹽酸小檗堿、鹽酸小檗紅堿、鹽酸黃柏堿各成分的含量，計算其RSD分別為0.8%，0.5%和0.7%，結果表明供試品重復性良好。

2.3.6 回收率試驗 取黃柏供試品0.02 g，樣品總數為6份，分別加入鹽酸小檗堿、鹽酸小檗紅堿和鹽酸黃柏堿對照品適量，按“2.3.1”項下操作。測得鹽酸小檗堿、鹽酸小檗紅堿和鹽酸黃柏堿的平均回收率分別為100.97%，101.83 %和100.08%，RSD分別為1.2%，2.0%和2.2%。說明該方法準確率高。見表2。

2.4 樣品含量測定

分別取黃柏炮制后各樣品，按2.2項下制備成供試品溶液，并按2.3.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，分別代入標準曲線，計算樣各供試品的含量，結果見表3。

3 討論

黃柏中的生物堿成分均為熱不穩定的原小檗堿生物堿，在酒炙和鹽炙的加熱過程發生分解，轉化成新的成分，故通過表3可以看出黃柏中原有的生物堿成分小檗堿和黃柏堿隨著溫度的增加含量降低，而炮制后的新成分小檗紅堿含量隨著溫度的升高而增加。在之前的預實驗發現，黃柏在炮制過程小檗堿可以生成小檗紅堿，而此反應的發生條件在120℃以上，故在120℃下未檢測到小檗堿的含量，同時根據分子構型并推測黃柏堿也會發生相似的反應，這其中的轉化過程需要進一步的研究。

流動相條件的確定：在預實驗中，對乙腈-（0.05 mol/L磷酸水溶液250 mL+二乙胺0.4 mL）（9︰91）[5]和為乙腈-0.4 mol/L氯化氨（12︰88）[6]，并對其進行考察，結果發現在應用于本實驗中發現了拖尾現象，故將流動相作為調整，最終確定流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL流動相加十二烷基硫酸鈉0.2 g），并在梯度洗脫的條件下分離效果好，保留時間適當，無其他雜質峰干擾。

提取條件的選擇，在預實驗的供試品制備過程中，直接用甲醇或加入1%鹽酸提取，對黃柏堿的溶出效果不好，只有在提取的甲醇溶液中加入1%醋酸可以促使黃柏堿溶出，并確保在高效液相上穩定出峰。

黃柏炮制的意義探索：黃柏性寒，經過酒炙可以降低寒性，而經過鹽炙之后可以緩和苦燥之性，免傷脾胃。實驗中發現黃柏經過炮制之后，其原有的生物堿成分——小檗堿和黃柏堿含量降低，這與傳統理論中的黃柏炮制之后可“緩和寒性”的理論相一致；此外，在炮制之后緩和寒性還體現了哪些藥理學指標以及炮制后新成分是否具有協同的藥效作用值得進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥出版社，2010：286.

[2] 陳枝嵐，謝守珍.14種中草藥體外抗白念珠菌作用研究[J].醫藥導報，2006，25（8）：765-767.

[3] 廉蓮，賈天柱.基于AVP-cAMP-AQP-2探討黃柏及其不同炮制品的滋陰作用[J].沈陽大學學報，2011，28（5）：400-404.

[4] 李峰，賈彥竹.黃柏的臨床藥理作用[J].中醫藥臨床雜志，2004，16（2）：191.

[5] 周德慶，郭志雄，羅澤淵，等.HPLC法測定黃柏中黃柏堿的含量[J].中成藥，2003，25（12）：1002-1004.

[6] 彭愛華，楊宏，楊林，等.RP-HPLC測定不同采收期川黃柏中小檗堿、黃柏堿的含量[J].華西藥學雜志，2006，21（4）：377-379.

（收稿日期：2012-10-19）