結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的藥物敏感性試驗分析

[摘要] 目的 研究吡嗪酰胺對結(jié)核桿菌的藥物敏感性，分析結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的耐藥現(xiàn)況，為結(jié)核病的臨床用藥和防治工作提供參考。 方法 對復活傳代成功的結(jié)核分枝桿菌進行抗酸染色后，采用絕對濃度法的間接法，選用含緩沖對的蛋黃瓊脂培養(yǎng)基，對結(jié)核桿菌菌株進行吡嗪酰胺的藥物敏感性測定。 結(jié)果 測定的60株結(jié)核分枝桿菌中有15株敏感，44株耐藥，一株未生長。結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺敏感率為25.42%（15/59），耐藥率為74.58%（44/59）。 結(jié)論 隨著吡嗪酰胺被廣泛使用治療，結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的耐藥性不斷增高，目前耐藥性比較高，臨床用藥時必須謹慎使用或聯(lián)用其他藥物有效治療。

[關鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；吡嗪酰胺；藥敏試驗；耐藥性

[中圖分類號] R969.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）01-31-03

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染性疾病，是現(xiàn)在世界上最普遍和最嚴重的人類傳染病之一，也是全世界由單一致病菌致死最多的疾病之一。由于耐藥性結(jié)核桿菌的出現(xiàn)與傳播、艾滋病的流行以及人口的頻繁流動等原因，結(jié)核病疫情呈現(xiàn)全球性回升。吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）作為治療結(jié)核病最有效的一線藥物之一，而被廣泛應用于短程化療方案中，最終導致耐吡嗪酰胺的結(jié)核菌也越來越多，因此進行PZA耐藥性的檢測，對臨床治療及控制結(jié)核病具有重要的意義。但由于吡嗪酰胺僅在pH為5.5～5.6的酸性條件下才能轉(zhuǎn)化為殺菌的吡嗪酸，而結(jié)核菌在酸性條件下生長很差，甚至不生長，從而導致吡嗪酰胺的藥敏試驗一直是實驗室中的一個難題[1]。目前，最常用于結(jié)核桿菌藥敏試驗的羅氏培養(yǎng)基的pH為6.5～6.8，將其調(diào)至pH為5.6則不適用結(jié)核菌良好生長，故難應用于PZA藥敏試驗[2]。然而應用蛋黃瓊脂培養(yǎng)基測定結(jié)核桿菌對PZA藥物敏感程度與應用羅氏培養(yǎng)基相比，可保證培養(yǎng)基在5.50～6.65范圍內(nèi)，在此環(huán)境中結(jié)核菌可以生長，PZA也可以發(fā)揮抑菌作用[3]。本試驗運用羅氏培養(yǎng)基復活結(jié)核桿菌再用含有緩沖對的蛋黃瓊脂培養(yǎng)基做藥敏試驗。由于吡嗪酰胺在體內(nèi)抑菌濃度為12.5μg/mL，達到50μg/mL可殺滅結(jié)核桿菌，且本品在細胞內(nèi)抑制結(jié)核桿菌的濃度比在細胞外低10倍，再參照文獻[3]，最后對60株傳代復活的結(jié)核菌株進行含吡嗪酰胺濃度為50μg/mL的藥敏試驗，進而對吡嗪酰胺的耐藥情況進行分析研究，為臨床用藥治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2005年11～12月中旬和2006年3～5月中旬，在廣州市黃石醫(yī)院檢查為疑似肺結(jié)核患者的痰液接種于羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)并保存于4℃冰箱的結(jié)核分枝桿菌菌株，當時病例發(fā)病前均無服用過抗結(jié)核藥物，或接受抗結(jié)核治療不足1個月。結(jié)核參考菌株（H37Rv敏感株）由廣州市胸科醫(yī)院提供，在4℃冰箱保存。

1.2 結(jié)核分枝桿菌的復活

1.2.1 培養(yǎng)基的成分 配制酸性羅氏培養(yǎng)基。成分：谷氨酸納（純度95%以上）3.6 g， KH2PO4 7 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，枸椽酸鎂 0.3 g，甘油6 mL，蒸餾水300 mL，馬鈴薯淀粉15 g，新鮮雞卵液500 mL，2%孔雀綠水溶液10 mL。

1.2.2 制備方法 各鹽類成分溶解后，加馬鈴薯淀粉，混勻，沸水浴煮沸1 h呈糊狀（不時搖動，防凝塊），待冷后，加經(jīng)消毒紗布過濾的新鮮雞卵液，混勻，再加入2%孔雀綠水溶液，混勻，分裝于經(jīng)121℃高壓滅菌的中型試管，每管加培養(yǎng)基7 mL，斜置血清凝固器內(nèi)1～2層，斜面高度占試管2/3，90℃ 1.5 h或85℃ 1 h間歇兩次（加熱使培養(yǎng)基凝固）。冷卻后，37℃無菌試驗24 h。培養(yǎng)基斜面顏色鮮艷，表面光滑無泡，有一定韌性和酸堿緩沖能力，4℃保存，1個月內(nèi)使用。

1.2.3 接種方法 用接種環(huán)挑取1～2環(huán)保存于4℃冰箱的結(jié)核菌菌株，轉(zhuǎn)接于酸性羅氏培養(yǎng)基，在斜面密集接種。每株結(jié)核菌同時接種兩支酸性改良羅氏培養(yǎng)基，每管要做好標記。此轉(zhuǎn)接過程需在生物安全柜里進行，注意無菌操作及個人防護措施。然后放于37℃恒溫箱培養(yǎng)。每周觀察1次，記錄細菌生長情況，2～3周為止（視結(jié)核菌生長情況而定）。

1.3 抗酸染色試驗

由于結(jié)核分枝桿菌為抗酸菌，用接種環(huán)取復活的結(jié)核桿菌1～2環(huán)，均勻涂于含有少量生理鹽水的載玻片上，待自然干燥，微火焰固定，抗酸染色鏡檢。在藍色背景上呈紅色的為抗酸菌，確證為結(jié)核分枝桿菌。

1.4 藥敏試驗

具體操作參照文獻[3]及一種新的吡嗪酰胺耐藥測定培養(yǎng)基的研制及結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程[4]。

1.4.1 藥品 吡嗪酰胺（廣東華南藥物有限公司，H51020878），純品，片狀。

1.4.2 培養(yǎng)基 蛋黃瓊脂培養(yǎng)基。配制方法如下：（1）基礎液配制。磷酸氫二鈉5.0 g，枸櫞酸2.1 g，磷酸二氫鉀2.4 g，枸櫞酸鎂0.6 g，天門冬素（味精）3.6（7.2）g，甘油12 mL，2%孔雀綠20 mL，瓊脂27.0 g，蒸餾水600 mL。將上述成分高壓滅菌后保持在60～65℃水浴待用。（2）稀釋蛋黃液。用新鮮雞蛋，在無菌條件下將蛋清除凈，留蛋黃。350 mL蛋黃加滅菌蒸餾 水（60～65℃）1 000 mL搖勻，置60～65℃水浴待用。（3）含吡嗪酰胺培養(yǎng)基的配制。無菌條件下，將基礎液與蛋黃稀釋液按6 ： 10的比例混合搖勻，用精密到5.4的pH試紙測定其pH值，固定磷酸氫二鈉的量，加入枸櫞酸調(diào)節(jié)凝固前培養(yǎng)基的pH值為5.4左右，結(jié)果多加枸櫞酸0.1 g。根據(jù)文獻[3]介紹，按照上述比例配制，培養(yǎng)基凝固前（50℃）pH值為5.41，凝固后（室溫）pH為5.63，符合吡嗪酰胺藥敏試驗要求。然后取部分上述蛋黃培養(yǎng)基分裝于經(jīng)高壓滅菌的中型試管，每管6 mL，置于斜面凝固，用作不含藥的對照培養(yǎng)基。按剩余培養(yǎng)基的量計算，加入一定量的粉狀PZA，制成濃度為50μg/mL的含吡嗪酰胺藥物培養(yǎng)基。同樣每管6 mL分裝于經(jīng)高壓滅菌的中型試管，置于斜面，凝固后待用。

1.4.3 菌懸液的制備 刮取初生長2周的培養(yǎng)物或經(jīng)2次傳代后生長2～3周的亞培養(yǎng)物（刮取斜面各個部分的培養(yǎng)物），置于裝有少量0.5%Tween-80生理鹽水的試管壁上，用玻璃棒研磨成乳酪狀并混于0.5%Tween-80生理鹽水內(nèi)，與麥氏標準比濁管比濁，配成1 mg/mL菌懸液。

1.4.4 接種方法 將1 mg/mL的菌懸液10倍稀釋至10～2 mg/mL，以滅菌吸管準確吸取0.1 mL分別接種于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基的斜面上，各管的接種量均為3～10 mg。置37℃孵育，4周觀察結(jié)果。

1.4.5 質(zhì)控 每批藥敏試驗應以結(jié)核分枝桿菌參考菌株（H37Rv）檢測含藥培養(yǎng)基質(zhì)量。

1.4.6 結(jié)果判定標準 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的菌落特點，在酸性羅氏培養(yǎng)基中形成顆粒狀或菜花形的乳酪色的粗糙型菌落，數(shù)量大時則是巧克力色判斷結(jié)核桿菌生長情況。

對照培養(yǎng)基菌落數(shù)必須在200以上且無融合。若菌落數(shù)低于50時，重新做藥物敏感性測定。（-）：培養(yǎng)基斜面上無分枝桿菌菌落生長。（+）：菌落數(shù)約占斜面面積的1/4。（2+）：菌落數(shù)約占斜面面積的1/2。（3+）：菌落數(shù)約占斜面面積的3/4。（4+）：菌落呈菌苔樣生長。

菌落數(shù)少于20個時，報告菌落數(shù)。含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)少于20個時，當作不生長。低濃度含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)多于20個時，即可判定為耐藥。低濃度生長、高濃度不生長為中度耐藥；高、低濃度均生長為高度耐藥。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計數(shù)資料采用x2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組與對照組菌株培養(yǎng)情況

60株培養(yǎng)結(jié)核菌株，對照培養(yǎng)基中有1株沒有生長，其余59株均生長，結(jié)果為4+，長滿整個斜面。菌落數(shù)均在200以上無融合。濃度50μg/mL的含藥培養(yǎng)基中，除了對照中沒有生長的1株外，其余59株中有15株生長，長滿整個斜面（4+），為敏感株；有44株一樣長出結(jié)核桿菌菌落（4+），為耐藥株?？梢?，藥敏試驗是有意義的。見表1。

2.2 59株結(jié)核桿菌菌株對吡嗪酰胺敏感性測定結(jié)果

測定的60株結(jié)核分枝桿菌中有15株敏感，44株耐藥，1株未生長。結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺敏感率為25.42%（15/59）， 耐藥率為74.58%（44/59）。

3 結(jié)論

吡嗪酰胺于Zhang Y等[5]在1940年由在合成氨基吡啶過程中作為一種中間化合物首次被合成的，它的抗結(jié)核菌活性于1952 年被Yeager等發(fā)現(xiàn)。但其與利福平和異煙肼聯(lián)用治療結(jié)核病顯著縮短化療時間的獨特作用是在其用于治療結(jié)核病29年之后的1981年才見報道[6]。往后，吡嗪酰胺在臨床用藥時常與其他抗結(jié)核藥（如鏈霉素、異煙肼、利福平及乙胺丁醇）聯(lián)合，用于治療結(jié)核病。PZA是一種煙酰胺類似物，與異煙肼相似也是一種抗MTB的原藥，但其發(fā)揮作用所要求的環(huán)境不同，吡嗪酰胺需要在酸性環(huán)境才表現(xiàn)抗菌活性且最低抑菌濃度（MIC）與pH值在7.0以下存在好的正相關性[7]。吡嗪酰胺通過被動擴散進入MTB細胞內(nèi)，在MTB細胞內(nèi)由吡嗪酰胺酶（PZase）將其轉(zhuǎn)化為具有抗MTB活性形式的吡嗪酸，所以PZase活性對吡嗪酰胺表現(xiàn)抗MTB活性是必需的。

目前，隨著臨床上廣泛應用吡嗪酰胺，導致結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的耐藥性不斷升高。敖軍平等[8-9]在結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥性的噬菌體檢測技術(shù)與耐藥基因突變研究中對109株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行PZA耐藥性測定，常規(guī)絕對濃度藥敏法檢測結(jié)果為敏感35株，耐藥74株；PhaB法檢測結(jié)果為敏感34株，耐藥75株，與絕對濃度法檢測結(jié)果的符合率為91.7%。兩種方法測得結(jié)核桿菌對吡嗪酰胺的耐藥率分別為67.89%，68.81%。本次試驗結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的耐藥率高達74.58%。相對于以往2.4%[3]的耐藥率，可見結(jié)核桿菌對吡嗪酰胺的敏感性大幅度下降，在未來的結(jié)核病防治工作中一定要對吡嗪酰胺的耐藥性加以監(jiān)控并且在臨床用藥治療時一定先謹慎檢測患者結(jié)核桿菌對吡嗪酰胺的耐藥程度，合理用藥。

結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的藥物敏感性大幅度下降也使得結(jié)核桿菌對吡嗪酰胺耐藥機制研究受到關注。由于編碼吡嗪酰胺酸的pncA基因突變而引起吡嗪酰胺酶活性下降是導致對吡嗪酰胺天然敏感的結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥的主要原因，牛分枝桿菌及其他分枝桿菌均對吡嗪酰胺天然耐藥，其機制各不相同[10]。出現(xiàn)這種情況很多都是由于治療過程中不合理的聯(lián)合用藥、間斷用藥、不執(zhí)行歸口管理與治療等。所以在今后的結(jié)核病防治工作中，重點為社會性綜合防治措施，抓好結(jié)核患者的發(fā)現(xiàn)、登記、管理和合理治療，定期做好吡嗪酰胺耐藥性的檢測，了解其耐藥情況，指導臨床合理用藥以降低其耐藥率。

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（收稿日期：2012-11-13）