EGFR、P16、Ki67和P53在宮頸鱗狀上皮內瘤變和宮頸鱗狀細胞癌中表達的臨床意義

[摘要] 目的 探討EGFR、P16、Ki67和P53在宮頸病變組織中的表達及臨床意義。 方法 應用免疫組化SP法檢測84例宮頸鱗狀上皮內瘤變（CIN）和30例宮頸鱗癌中EGFR、P16、Ki67和P53的表達，另選取20例正常宮頸組織作為對照。 結果 EGFR、P16、Ki67和P53在正常宮頸組織中陽性率分別為10.00%、0、5.00%及5.00%；在CIN中陽性率分別為33.33%、82.14%、54.76%及47.62%；在宮頸鱗癌中陽性率分別為56.67%、100.00%、86.67%及76.67%，差異均有統計學意義（P < 0.05）。EGFR、P16、Ki67和P53表達強度均隨宮頸病變的進展而增加，表達均有統計學意義（P < 0.05）。EGFR、P16、Ki67和 P53表達在CIN和鱗癌中兩兩比較均呈顯著性正相關（P < 0.05）。結論 EGFR、P16、Ki67和P53可能參與了宮頸癌病變的發生及發展，聯合檢測四者可作為CIN分級與鱗癌診斷的重要參考指標。

[關鍵詞] 宮頸上皮內瘤變；宮頸鱗癌；EGFR；P16；Ki67；P53；免疫組織化學

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）02-0087-04

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，最常見的組織學類型是鱗狀細胞癌，其發病是從宮頸鱗狀上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）到浸潤性癌的一個連續發展的過程。由于宮頸癌具有發展慢、發病隱匿的特點，早期可無明顯癥狀，因此在宮頸癌前病變階段找到預示病變進展的標志物對宮頸癌防治意義重大，是宮頸癌得以早期診斷進而提高治愈率和生存率的關鍵。

近年來，國內外研究表明，宮頸上皮腫瘤的發生、發展及預后與多種基因蛋白的變化密切相關。表皮生長因子受體（EGFR）是蛋白酪氨酸激酶生長因子受體家族的一員，是一種相對分子質量為170 000的跨膜糖蛋白，其過表達與腫瘤的發生發展密切相關。P16是一種新型抑癌基因，參與了腫瘤發生發展的周期調控。Ki67是一種與增殖細胞相關的核抗原，是細胞增殖標記物，反映腫瘤的增殖活性。P53基因突變是人類惡性腫瘤最常見的一種分子改變。

本研究聯合檢測EGFR、P16、Ki67和 P53在宮頸病變中的表達和意義，旨在探討四者在宮頸病變發生發展中的作用以及可能的診斷價值和治療意義。

1 材料與方法

1.1 材料

所有標本均取自于我院2008年6月～2011年3月宮頸活檢/錐切及手術切除標本，共114例，其中CIN 84例（CINⅠ24例，CINⅡ32例，CINⅢ28例），宮頸鱗癌30例，參照2003版WHO腫瘤病理學及遺傳學分類：女性生殖器官腫瘤的宮頸腫瘤組織學分類標準。所有患者術前均未進行放、化療和免疫治療；另選取同院同期相應的20例正常宮頸組織作為對照。所有標本均經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片。

1.2 方法

1.2.1 方法 鼠抗人EGFR單克隆抗體、鼠抗人P16單克隆抗體、鼠抗人Ki67單克隆抗體、鼠抗人P53單克隆抗體及SP試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。采用免疫組化SP法，以PBS代替一抗為陰性對照，以已知陽性片作為陽性對照。

1.2.2 結果判斷 EGFR陽性定位于細胞膜或細胞漿，P16陽性定位在細胞核和（或）胞漿，Ki67和P53陽性定位在細胞核，凡出現黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，以無陽性瘤細胞或陽性細胞數<10%為陰性；陽性瘤細胞>10%為陽性。其中按陽性細胞占腫瘤細胞百分比分為3個等級：陽性瘤細胞數占10%～25%為（+），占25%～50%為（++），>50%為（+++）。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件進行χ2檢驗，以P﹤0.05為有顯著性差異。

2結果

2.1 EGFR、P16、Ki67和 P53的表達

EGFR、P16、Ki67和P53在正常宮頸組織中陽性率分別為10.00%、0、5.00%及5.00%；在CIN中陽性率分別為33.33%、82.14%、54.76%及47.62%；在宮頸鱗癌中陽性率分別為56.67%、100.00%、86.67%及76.67%。四種蛋白在正常組、CIN組與鱗癌組相比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖1～4及表1。

2.2 EGFR、P16、Ki67和 P53在不同宮頸鱗狀上皮內瘤變分級中的表達

EGFR在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ中陽性率分別為12.5%、37.5%和46.43%，在CINⅠ與CINⅡ，CINⅠ和CINⅢ中表達差異有統計學意義（P < 0.05）。P16在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ中陽性率分別為62.5%、81.25%和100%，在CINⅡ和CINⅢ，CINⅠ和CINⅢ中表達差異有統計學意義（P < 0.05）。Ki67在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ中陽性率分別為41.67%、50%和71.43%，在CINⅠ和CINⅢ中表達差異有統計學意義（P < 0.05）。P53在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ中陽性率分別為29.17%、46.88%和64.29%，在CINⅠ和CINⅢ中表達差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 EGFR、P16、Ki67和 P53在宮頸病變中表達的相關性

Spearman相關檢驗顯示，在CIN和鱗癌中EGFR、P16、Ki67和 P53表達兩兩比較均呈顯著性正相關（r1 = 0.208，r2 = 0.245，r3 = 0.221，r4 = 0.241，r5 = 0.224，r6 = 0.227，P <0.05）。

3 討論

宮頸癌現已占女性惡性腫瘤的第2位，近年來發病率明顯增高，且呈明顯的年輕化現象。宮頸癌是由癌前病變，即CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ逐步發展到浸潤性癌，但并非所有的CIN均進展為癌，從CIN發展為宮頸癌需經歷較長時間，約10年左右。由于主觀因素或病變不典型，常造成診斷上的漏診或誤診，因此臨床上多數CIN的女性患者經受了不必要的過度治療，如能預測早期CIN病變進展，得到及時正確的診斷和恰當的治療可避免CIN患者的過度治療。

表皮生長因子受體（EGFR）廣泛分布于人體器官中，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，是原癌基因c-erbB-1的表達產物，是參與信號傳導、細胞周期調控的關鍵分子，在許多惡性腫瘤中過表達[1，2]。本研究結果顯示，EGFR表達隨著宮頸病變的進展而增加，且隨著CIN分級增加其陽性強度增加，與王玨[3]等、馮淑瑜[4]等報道一致，提示EGFR對宮頸癌的發生發展過程可能起促進作用，EGFR受體的激活可導致細胞無自主性增殖，從而導致惡性腫瘤的發生[5]，故EGFR對宮頸癌的早期診治有一定指導意義，其高表達對宮頸癌的增殖及浸潤有促進作用，可作為判定宮頸癌腫瘤細胞增殖活躍及預后的一個參考指標。

近年越來越多的研究表明，細胞生長周期的失調在人類腫瘤的發生中起重要作用。P16蛋白是1994年6月由Kamb報道的一種新型抑癌基因，在許多腫瘤中發生突變、缺失，引起細胞周期調節紊亂，使細胞無限制增生，甚至癌變。目前已有報道在多種惡性腫瘤中均有P16的失活[6]。本研究結果顯示，P16蛋白的陽性表達率在正常宮頸組織與宮頸CIN以及宮頸癌組織相比較，差異顯著，且隨著CIN分級增加其陽性強度增加，與程淑霞等[7]、董磊等[8]報道一致，提示P16蛋白與宮頸癌的發生發展及其癌前病變有密切關系，P16蛋白的高表達是子宮頸正常組織-CIN-癌發生過程中的早期事件，Salit等[9]也曾報道，P16蛋白表達異常是腫瘤發生的早期事件。P16蛋白表達異常在惡性腫瘤發生發展中的重要作用可作為輔助臨床評價腫瘤生物學行為及判斷預后的輔助指標。因此，檢測P16蛋白可幫助我們診斷宮頸癌前病變及宮頸癌，提高早期診斷率，從而進行早期及時的治療。

Ki67是一個細胞增殖的相關蛋白，被廣泛用以評估腫瘤細胞的增殖能力[10]，其表達與腫瘤的惡性程度及預后有關，在惡性腫瘤侵襲轉移過程中起重要作用[11]。已有研究發現，Ki67有可能作為確定癌變人群高危個體的生物學標志物，其表達與多種腫瘤的發生發展、浸潤轉移有關。近年來文獻報道[12，13]，多種腫瘤及癌前病變中均存在Ki67的過度表達，因此推測Ki67可能是一種原癌基因，其表達過度導致腫瘤的發生。本研究結果發現，隨著宮頸病變的進展，Ki67指數逐漸增高，且隨CIN級別的升高而升高，與譚偉堅等[14]報道相同，提示在宮頸癌發生發展過程中細胞增殖活性也逐漸增強，進一步證實了宮頸癌的發生是一個逐步發展的過程。Carreras等[15]研究也認為，Ki67與宮頸病變的嚴重程度相關，可作為鑒別診斷的指標。所以Ki67是一個在預測宮頸CIN和宮頸癌的發生發展中有重要參考價值的標記物，對腫瘤的治療和預后有指導意義。

P53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因，其基因產物定位于細胞核，是一種細胞周期相關蛋白。P53蛋白分為野生型及突變型兩種，野生型蛋白在正常細胞中呈低水平表達，突變型P53蛋白在腫瘤細胞中常常高表達，并失去抑癌功能，可引起細胞惡性增殖而導致腫瘤的發生及癌變。本研究結果顯示，在正常宮頸組織、CIN 和宮頸鱗癌中P53陽性表達呈遞增趨勢且隨宮頸CIN 分級增加而增加，與黃海萍等報道[16]一致，提示P53過表達在CIN及宮頸鱗癌的發生發展中起重要作用，其檢測可為宮頸癌早期診斷和子宮頸上皮內瘤變指導治療及判斷預后。

當機體發生腫瘤時常常發現EGFR的過度表達。EGFR可促進腫瘤細胞的增殖，并抑制腫瘤細胞的凋亡[17]。Mathur等[5]研究發現，宮頸癌中HPV-E6/E7表達水平與EGFR表達存在相關性，推測HPV-E6/E7蛋白導致EGFR表達增高可能是通過腫瘤抑制基因P53介導的。P16抑制腫瘤細胞的生長，其缺失可導致腫瘤的發生。Ki67反映宮頸癌細胞增殖指數。本研究聯合檢測EGFR、P16、Ki67和P53在CIN和宮頸鱗癌中的表達，顯示四者具有明顯相關性，呈正相關，在宮頸病變腫瘤的發生發展中起協同作用，與宮頸癌前病變發生機制及病變進展相關，可作為早期診斷宮頸癌前病變及宮頸癌的標記物，對早期準確診斷有著積極的意義，其檢測可作為宮頸CIN 分級與鱗癌診斷的重要輔助指標。EGFR、P16、Ki67和P53共同陽性表達率隨著病變程度加重而增高，提示宮頸癌的發生是多基因調控、多因素協同作用所導致的，四者均參與子宮頸癌前病變及癌變的發生發展。

準確客觀的腫瘤診斷和分級對臨床進一步治療以及預后評價是至關重要的，臨床上多種基因的同時檢測，能協助診斷子宮頸癌前病變及癌變，有效減少實際工作中的誤診和漏診，從而為提高診斷子宮頸癌前病變及子宮頸鱗癌的準確率提供依據，有利于監控子宮頸癌的發生和發展以及預后的評估。因此，聯合檢測EGFR、P16、Ki67和P53的表達，了解四者可能在宮頸癌的發生發展中所起的重要作用，有可能對早期診斷子宮頸癌前病變及子宮頸癌、有選擇地進行早期治療、提高宮頸癌的治愈率和生存率、對估計患者的預后有重要的意義。

[參考文獻]

[1] Sharma SV，Bell DW，Settleman J，et al. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer[J]. Nat Rev Cancer，2007，7（3）：169-181.

[2] Brustmann H. Epidermal growth factor receptor expression in serous ovarian carcinoma：an immunohistochemical study with galectin-3 and cyclin D1 and outcome[J]. Int J Gynecol Pathol，2008，27（3）：380-389.

[3] 王玨. EGFR和p16在宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中的表達[J]. 交通醫學，2009，23（6）：613-614.

[4] 馮淑瑜，張彥娜，劉繼紅，等. 宮頸癌和宮頸上皮內瘤變中表皮生長因子受體表達與人乳頭瘤病毒16和（或）18感染及其相互關系[J].中華腫瘤雜志，2007，29（10）：759-763.

[5] Mathur SP，Mathur RS，Rust PF，et al. Human papilloma virus（HPV）-E6/E7 and epidermal growth factor receptor（EGFR）protein levels in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia（CIN）[J]. Am J Reprod Immunol，2001，46（4）：280-287.

[6] Lee ES，Kim LH，Abdullah WA，et al. Expression and alteration of P16 in diffuse large B cell lymphoma.[J]. Pathobiology，2010，77（2）：96-105.

[7] 程淑霞，趙先蘭. 子宮頸癌及上皮內瘤變中高危型HPV感染與pl6INK4A、PTEN蛋白表達的關系[D]. 鄭州大學，2007.

[8] 董磊，宋張娟. 宮頸鱗癌中pl6、p21WAF1、Rb、Cyclin E蛋白的表達[J].臨床與實驗病理學雜志，2004，20（5）：554-556.

[9] Salit IE，Tinmouth J，Chong S，et al. Screening for HIV-associated anal cancer：correlation of HPV genotypes，P16，and E6 transcripts with anal pathology[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18（7）：1986-1992.

[10] Beenken SW，Bland KI. Biomarkers for breast cancer[J]. Minerva Chir，2002，57（4）：437-448.

[11] 林岷，江忠清，游彩玲，等. Ki-67抗原在宮頸癌的表達和臨床意義[J]. 中國現代醫學雜志，2003，l2（13）：9-11.

[12] Silva SD，Agostini M，Nishimoto IN，et al. Expression of fatty acid synthase，ErbB2 and Ki67 in head and neck squamous cell carcinoma. A clinicopathological study[J]. Oral Oncol，2004，40（7）：688-696.

[13] 賈學玲，高云荷，張煦. 子宮內膜增生及內膜癌中PTEN、Ki-67蛋白的表達[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2003，19（2）：152-155.

[14] 譚偉堅，張曉薇，林仲秋，等. 宮頸上皮內瘤變及宮頸鱗癌中 cyclin D1、Ki-67的表達及其意義[J]. 中國病理生理雜志，2010，26（2）：390-392、400.

[15] Carreras R，Alameda F，Mancebo G，et al. A study of Ki67，C-erbB2 and cyclin D1 expression in CIN，CINⅢ and squamous cell carcinoma of the cervix[J]. Histol Histopathol，2007，22（6）：587-592.

[16] 黃海萍，葉學正，周琦，等. p53、p16 在宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中的表達及意義探討[J]. 腫瘤預防與治療，2008，21（2）：136-139.

[17] Liakakos T，Fatourou E，Ziogas D，et al. Targeting VEGF，EGFR，and other interacting pathways for gastric cancer-promises and reality[J]. Ann Surg Oncol，2008，15（10）：2981-2982.

（收稿日期：2012-11-22）