上海動物園三種野生禽類新城疫免疫效果評估

王瑛瑩 陳曉蘭 桂劍峰 朱向蕾 陸旖旎 袁耀華

(上海動物園，上海，200335)

雞(Gallusgallusdomesticus)新城疫(Neweastle disease，ND)是一種高度接觸性致死性傳染病，是當前危害禽類最嚴重的傳染病之一，[1-3]，被世界動物衛生組織(OIE)列為A類動物疫病。新城疫病毒(NDV)可感染50個鳥目(Aves)中27個目240種以上的禽類，主要感染雞、鴿(Columbidae)、鵪鶉(Coturnixjaponica)、火雞(Meleagrisspp.)等[4]。近年來，其宿主范圍有擴大的趨勢，鵝鴨等水禽也可感染發病[5-6]。因此，應當對新城疫病毒對野生禽類及人類健康的威脅引起重視。

上海動物園圈養野生禽類種類豐富，目前有鳥類近20個目，200余種供游客觀賞，且每年會有外來野生鳥類在此棲息。因此，上海動物園具有NDV傳播和爆發的風險，應隨時監測新城疫疫情，并充分做好免疫防控的監測工作[7-8]。目前，疫苗免疫是防控野禽新城疫的主要措施[9]。上海動物園針對新城疫每年春秋兩季對圈養野禽進行疫苗免疫，然而，上海動物園現行免疫程序下現用家禽疫苗對野生禽類的保護作用尚不清楚。為了查明現用NDV疫苗對上海動物園野生禽類的保護效果，本文就上海動物園2017年度野生禽類新城疫疫苗免疫效果進行評估，以期為野生禽類新城疫疾病的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

選取上海動物園圈養的3種不同的野生禽類共48只，其中東方白鸛(Ciconiaboyciana)11只，孔雀(Pavospp.)25只，白鷴(Lophuranycthemera)12只。所有的野禽于2017年3月進行新城疫疫苗免疫。

1.1.2 疫苗

雞新城疫滅活疫苗(CLONE30株)為英特威國際有限公司產品；MA5+CLONE30新支二聯弱毒苗由英特威國際有限公司生產。

1.1.3 檢測試劑

新城疫血凝抑制試驗抗原、陽性血清，均購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。紅細胞懸液按照GB/T 18936—2003標準進行制備。

1%雞紅細胞懸液由本實驗室制備，具體如下：采集3只無新城疫抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH 7.2的0.01 mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1 000 r/min離心10 min，洗滌后用PBS配成體積分數為1%紅細胞懸液，4℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 疫苗免疫

采用滅活疫苗肌肉注射和弱毒疫苗點眼免疫的聯合免疫方式對野禽進行免疫。具體如下：使用雞新城疫滅活疫苗(CLONE30株)進行肌肉注射，根據野禽體重大小疫苗接種量為0.5—2 mL/羽；同時使用2頭份/羽的免疫劑量點眼免疫MA5+CLONE30新支二聯弱毒苗。所有免疫野禽都套上腳標，做好編號。

1.2.2 血清采集

免疫前和免疫后21 d、30 d、60 d、120 d和180 d按時對免疫禽無菌采集血液，分離血清，冷凍保存。

1.2.3 抗體檢測

新城疫HI抗體檢測按照GB/T 16550—2008新城疫診斷技術標準規定的方法進行血清抗體水平的測定。結果判定：以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數作為HI效價，只有陰性對照孔效價不大于2 log2，陽性對照孔效價誤差不超過1個滴度時，試驗結果才有效。按照農業農村部相關標準，新城疫HI效價≥4 log2判為免疫合格。

2 結果和討論

2.1 血液樣品采集程序、疫苗免疫

上海動物園新城疫疫苗免疫程序為每半年免疫1次，分為春季免疫和秋季免疫，兩次免疫所使用的疫苗和免疫程序均相同。血液樣品采集分為6個時間點，分別在春季免疫前，免疫后21 d、30 d、60 d、120 d和180 d。血液樣品采集及免疫程序見圖1。

2.2 免疫前和免疫后180 d內新城疫抗體滴度分析

對東方白鸛、孔雀和白鷴的新城疫抗體滴度監測發現，在所有的監測時間點，新城疫抗體滴度個體雖差異較大，但均達到國家要求的最低標準(4 log2)。東方白鸛、孔雀和白鷴總體平均抗體滴度分別為(7.45±1.49)log2、(9.09±1.61)log2和(8.70±1.24)log2。

圖1 上海動物園免疫及采血程序Fig.1 The immunization procedure and blood collection point

表1 新城疫病毒抗體滴度檢測結果Tab.1 The antibody titers against Newcastle disease virus

續表1

注：“/”表示因樣品采集不全未進行檢測；抗體平均值表示為：平均值±標準差
Note：“/”Indicates that the test was not performed.The mean value of the antibody titers：mean value±standard deviation

圖2 野禽新城疫病毒抗體滴度變化曲線Fig.2 The curve of the NDV antibody titers on wild fowls

2.3 NDV免疫365 d后抗體狀態

上海動物園園內展出動物按照現階段的免疫程序進行接種疫苗，故對展出動物抗體滴度監測最多持續180 d，隨后動物即進入下一個免疫程序。為了進一步了解180 d后相關野禽的新城疫的抗體水平，另選取11只孔雀和6只東方白鸛為研究對象，對單次免疫后12個月和15個月的新城疫抗體滴度進行檢測(圖3A)，具體抗體滴度信息見表2。

表2 免疫365 d后孔雀和東方白鸛抗體滴度Tab.2 The NDV antibody titers of the peacock and Oriental stork over 365 days

圖3 NDV免疫后12個月和15個月野鳥抗體滴度分析A.免疫及采血程序；B.孔雀和東方白鸛NDV抗體滴度分析。*表示P<0.05Fig.3 Analysis of antibody titers at 12 and 15 months after immunizationA.The immunization procedure and blood collection point.B.The NDV antibody titers of the peacoke and Oriental stork.*Indicates P<0.05

3 討論與分析

免疫后應激反應是疫苗效果評價的重要指標之一，疫苗免疫后對本項目中3種野禽(東方白鶴、孔雀和白鷴)的生活狀態進行觀察，經過連續3周觀察發現，新城疫疫苗注射未對野禽的飲食、運動等行為造成較大影響，無野禽死亡。每次采血后，對采血動物進行3—5 d觀察，未發現較大的應激反應。

目前，動物園一般都采用滅活苗和弱毒苗聯合免疫的方式來預防新城[10-11]。滅活油苗能不斷地刺激機體產生高濃度的抗體，且維持時間很長，但刺激機體產生抗體所用的時間需要14—20 d，所以，它引起的抗體空白期長[12]。弱毒苗免疫后能在很短的時間內發生免疫作用，刺激黏膜免疫，但免疫產生的抗體濃度低[13]。溫榮輝等[14]報道的孔雀養殖場單獨使用ND三價弱毒苗進行免疫免疫后發生新城疫疫情；張玲莉等[15]報道的單獨使用新支二聯弱毒苗免疫后70 d孔雀的平均抗體滴度是4.7 log2，接近有效保護水平臨界值。本研究中弱毒苗和滅活苗聯合使用，接種后21 d孔雀抗體滴度是9.93 log2，120 d孔雀抗體滴度是9.27 log2，抗體水平高且均勻，并且免疫期比單獨使用弱毒活疫苗要長。這表明上海動物園采用的滅活疫苗和弱毒疫苗聯合免疫防控新城疫可行有效。

本研究中，新城疫疫苗免疫后，東方白鸛、白鷴和孔雀新城疫抗體滴度呈現先升高后逐漸降低的過程(圖2)。值得注意的是，在相同的疫苗接種程序和類似的飼養條件下，3種野禽新城疫抗體滴度存在較大差異，孔雀的新城疫抗體滴度最高，白鷴次之，東方白鸛新城疫抗體滴度最低，且3種野禽達到滴度峰值的時間是不同的，表明所使用的疫苗對3種野禽免疫效果存在一定差異。

對免疫后3種野禽新城疫抗體滴度橫向比較發現，東方白鸛新城疫整體抗體水平明顯低于孔雀和白鸛。此外，雖然經疫苗免疫后東方白鸛新城疫抗體均達到國家標準，但東方白鸛65次有效檢測中，21次抗體滴度小于或等于6 log2，僅略高于國家標準5 log2。應排查造成東方白鸛新城疫抗體滴度低的原因，并根據原因優化調整東方白鸛的新城疫接種程序。應加強東方白鸛新城疫抗體水平監測并在免疫接種時予以重點關注。

免疫程序的制定是因機體的免疫應答能力而定，經過此次抗體監測可知，不同種屬的野禽注射疫苗后，抗體滴度是有差異的。種屬間表現出的差異可能與其生理結構和自身的免疫機制不同有關，相關問題還有待深入研究探討。因此，對于野生禽類來說，若要達到疫苗的免疫效果和有效的保護時間，需針對不同種屬制定合理的免疫程序。上海動物園采用的新城疫免疫程序能夠使東方白鸛、孔雀、白鷴等野禽產生符合國家標準的抗體滴度。疫苗免疫后180 d，東方白鸛、孔雀、白鷴的新城疫抗體滴度分別為7.13 log2、9.15 log2、7.72 log2；即使免疫后15個月，抗體水平仍然符合國家標準。建議延長兩種疫苗的免疫間隔，以減少野禽抓捕和疫苗接種引起的應激反應并降低疾病防控經濟成本。