柚皮苷促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化能力的研究

[摘要]目的：研究柚皮苷對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞（HPDLCs）成骨分化能力的影響。方法：組織塊法培養(yǎng)原代HPDLCs，加入含不同濃度柚皮苷的培養(yǎng)液（100、10、1、0.1、0.01 mg/L），用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測(cè)HPDLCs的培養(yǎng)上清液中ALP的活性，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)加入柚皮苷后不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），HPDLCs的骨形成蛋白2（BMP2）、I型膠原蛋白（Col I）、骨保護(hù)蛋白（OPG）和核因子κb受體活化因子配體（RANKL）的mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，不同濃度柚皮苷試驗(yàn)組HPDLCs培養(yǎng)上清液中的ALP活性顯著增高（P<0.05），其中1mg/L組的ALP活性最高，此濃度柚皮苷作用下，24h后，BMP-2的mRNA表達(dá)水平顯著升高，并呈時(shí)間依賴性，48h后，Col I和OPG的mRNA表達(dá)水平也顯著上升。結(jié)論：柚皮苷促進(jìn)了HPDLCs細(xì)胞向骨細(xì)胞分化功能，其作用可能是通過(guò)上調(diào)Coll I、BMP2和OPG基因的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]柚皮苷；人牙周膜成纖維細(xì)胞；骨形成蛋白2；骨保護(hù)蛋白

[中圖分類號(hào)]R782 Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）03-0355-05

柚皮苷（Naringin）全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，是骨碎補(bǔ)的主要活性成分[1]。Zhang等[2]的研究證實(shí)柚皮苷可以促進(jìn)骨基質(zhì)干細(xì)胞的增殖并且向成骨細(xì)胞的分化。牙周膜細(xì)胞在牙周組織的再生和修復(fù)中起重要作用。最新研究表明，柚皮苷可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖和成骨分化的潛能[3-7]。然而，柚皮苷通過(guò)何種分子途徑促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的成骨分化尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究旨在觀察柚皮苷對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞的分化能力的影響，進(jìn)一步探討其促進(jìn)牙周組織改建的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1主要試劑與儀器：柚皮苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，用含10%FBS的DMEM配制，濃度為100、10、1、0.1、0.01mg/L）胎牛血清（FBS， Gibco，美國(guó)），DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），雙抗 （青霉素100U/L、鏈霉素100μg/L，Sigma公司，美國(guó)），ALP檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），MTT（Sigma公司，美國(guó)），二甲基亞砜（DMSO，天津匯英化學(xué)試劑有限公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio Tek公司，美國(guó)）， TRIZOL Reagent（Invitrogen，美國(guó)），PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒 （Perfect Real Time，Takara Bio公司）。

1.2人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)：牙周組織樣本來(lái)自于本院口腔科門(mén)診。選取3個(gè)健康個(gè)體，因正畸治療需要拔除的正畸牙6顆，平均年齡12～14歲。臨床檢查排除急性感染、全身系統(tǒng)性疾病史、家族遺傳病史、吸煙史、特殊服藥史以及牙體及根尖病變。本實(shí)驗(yàn)所用牙齒均經(jīng)過(guò)患者本人同意，并簽署了知情同意書(shū)。原代PDLSCs培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，無(wú)菌條件下刮取根中1/3的牙周膜組織，采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)及常規(guī)傳代培養(yǎng)。取3～5代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3 ALP活性檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HPDLCs細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔1×104細(xì)胞。置于37℃、5%CO2，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞，再換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24 h，分別于每孔加入含終濃度為100、10、1、0.1、0.01mg/L柚皮苷的培養(yǎng)液，以不含柚皮苷的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)后24h、48h、72h，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)各組HPDLCs上清液中ALP的濃度，每孔加入ALP反應(yīng)底物100μl，37℃孵育30 min，0.2 mol/L NaOH 50μl終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上410nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔A值，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果取均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度計(jì)算ALP的活性（U/ml）。

1.4 總RNA的提取：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HPDLCs細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔1×106細(xì)胞。置于37℃、5%CO2，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞，再換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24h，分別于每孔加入含終濃度為1mg/L柚皮苷的培養(yǎng)液，以不含柚皮苷的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組，于培養(yǎng)后24h、48h、72h，分別收集細(xì)胞，采用酚-氯仿提取法提取RNA，具體步驟按照TRIZOL Reagent產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 Real-time PCR：將已測(cè)得濃度的RNA按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit （Perfect Real Time） 試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。按照SYBRR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明書(shū)，將cDNA加入擴(kuò)增體系。使用20μl反應(yīng)體系進(jìn)行加樣，即：2μl樣本DNA，0.5μl正向引物，0.5μl反向引物，7μlDEPC水，10μl SYBR Premix Ex Taq。引物序列見(jiàn)表1。所有測(cè)定在7500 Real Time PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)）中進(jìn)行三次。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性10s 1個(gè)循環(huán)，95°C （變性） 5s和60°C （退火和延伸） 20s 40個(gè)循環(huán)。mRNA的相對(duì)濃度通過(guò)公式x= 2-ΔΔCt計(jì)算，其中x =各時(shí)間點(diǎn)目的基因經(jīng)內(nèi)參β-actin校正后相對(duì)于對(duì)照24h組的倍數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用x±s表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)HPDLCs細(xì)胞ALP活性的影響：與對(duì)照組比較，24h、48h和72h后，濃度為1、10、100mg/L的柚皮苷可增強(qiáng)HPDLCS的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性（P<0.01），72h后，0.1mg/L的柚皮苷也可增強(qiáng)HPDLCS的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性（P<0.05）。其中1mg/L的柚皮苷在各時(shí)間點(diǎn)增強(qiáng)ALP的活性均為最高（表2）。

2.2 柚皮苷對(duì)HPDLCs細(xì)胞BMP-2、Col I、OPG、RANKL的mRNA表達(dá)水平的影響：將1mg/L濃度的柚皮苷作用于HPDLCs，24h后，BMP-2基因的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），并呈時(shí)間依賴性，48h后，Col I和OPG的基因表達(dá)也顯著上升（P<0.05），三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，RANKL基因的表達(dá)與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著變化。OPG/RANKL的比值在48h和72h均顯著增高（圖1）。

3 討論

慢性炎癥疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牙周炎等，是最為常見(jiàn)的引起骨質(zhì)破壞的一類疾病。牙周炎所致的牙槽骨吸收是不可逆的，牙周附著也難以完全恢復(fù)至生理狀態(tài)，因而目前臨床上僅能控制、但不能根治牙周炎。缺乏療效確切的阻斷牙槽骨吸收、促進(jìn)牙槽骨再生的藥物，是根治牙周炎困難的主要原因。牙周膜細(xì)胞是具有多種生物學(xué)功能和分化潛能的細(xì)胞群，能夠維持牙周膜功能的穩(wěn)定，在維持正常的牙周組織更新和牙周炎癥組織損傷修復(fù)中起到了重要的作用。如何促進(jìn)來(lái)源牙周膜的細(xì)胞向形成牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)的方向分化，重建牙周組織，是牙周病治療研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶， 是潛在的新藥來(lái)源。從療效可靠的骨傷科常用中草藥中篩選抑制骨吸收、促進(jìn)骨再生的有效成分，是尋找治療牙周炎新藥的途徑之一。近期的研究[3]表明，骨碎補(bǔ)的活性成分柚皮苷可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖，蛋白質(zhì)合成增加，細(xì)胞代謝更旺盛，功能更活躍。ALP是成纖維細(xì)胞前體細(xì)胞成骨樣細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志，其活性高低可反映不同組織、細(xì)胞的礦化能力和向成骨方向轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)[9]。本研究進(jìn)一步證實(shí)24h、48h和72h后，濃度為1、10、100mg/L的柚皮苷可增強(qiáng)HPDLCS的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP的活性，呈時(shí)間依賴性，且最適濃度為1 mg/L。牙周膜細(xì)胞分泌大量的I型膠原，I型膠原也是骨基質(zhì)的主要成分，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度反映了細(xì)胞的礦化狀態(tài)。因此，對(duì)于衡量HPDLCS的成骨能力，I型膠原的合成是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。本研究證明柚皮苷促進(jìn)了HPDLCS的I型膠原的基因表達(dá)，可見(jiàn)柚皮苷參與調(diào)節(jié)了HPDLCS的骨代謝。

BMPs是最早發(fā)現(xiàn)的具有誘導(dǎo)骨形成作用的細(xì)胞因子，BMP-2作為T(mén)GF-β超家族中的成員，有很強(qiáng)的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化功能。Wong等[10-11]的研究表明，柚皮苷和膠原支架的聯(lián)合應(yīng)用可以促進(jìn)兔顱骨缺損的快速修復(fù)，表現(xiàn)為成骨細(xì)胞中BMP-2表達(dá)增加，從而促進(jìn)周圍新骨生成，這種作用與其HMG-CoA還原酶抑制作用有關(guān)。進(jìn)一步的研究[12-14]表明柚皮苷可以促進(jìn)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖、分化、礦化以及BMP-2的表達(dá)，并且通過(guò)PI3K和Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)。我們的研究證明柚皮苷加入后，24h起即顯著促進(jìn)了HPDLCs的BMP-2基因的表達(dá)。

OPG/RANKL系統(tǒng)是調(diào)節(jié)骨代謝的核心因子，OPG通過(guò)對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)控（抑制破骨細(xì)胞的形成和活性） 從而發(fā)揮著重要作用，RANKL是誘使破骨細(xì)胞分化和激活的關(guān)鍵因素，它可促使破骨細(xì)胞前體融合為多核細(xì)胞并活化為破骨細(xì)胞，并能抑制破骨細(xì)胞凋亡，從而最終導(dǎo)致骨吸收。OPG通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL而阻斷RANKL與其受體RANK的作用以達(dá)到護(hù)骨作用[15]。因此局部微環(huán)境中RANKL和OPG 表達(dá)的相對(duì)水平是決定破骨細(xì)胞形成及其活性的關(guān)鍵，若OPG基因表達(dá)水平高于RANKL，則破骨細(xì)胞形成受抑，相反則破骨細(xì)胞形成活躍。本研究表明，柚皮苷作用48h后，HPDLCS的OPG基因的表達(dá)顯著上升，而RANKL基因的表達(dá)沒(méi)有顯著變化。OPG/RANKL的比值在48h和72h均顯著增高，柚皮苷通過(guò)促進(jìn)OPG的表達(dá)來(lái)上調(diào)OPG/RANKL的比值從而起到促進(jìn)HPDLCS的成骨基質(zhì)分泌的作用[16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步證明，骨碎補(bǔ)中的有效成分柚皮苷通過(guò)上調(diào)I型膠原，BMP-2，OPG的表達(dá)，從而增強(qiáng)了HPDLCs的ALP的活性及成骨代謝能力。

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[收稿日期]2012-11-25 [修回日期]2013-02-02

編輯/張惠娟