人臍帶沃頓膠間充質干細胞研究及其在心血管組織工程中的應用現狀

間充質干細胞（ mesenchymal stem cells，MSCs）是干細胞家族的重要成員，來源于早期中胚層和外胚層的一類多能干細胞。MSCs最初在骨髓中發現，隨后在多種組織中分離得到，包括肌肉、脂肪、大腦、軟骨、牙髓以及臍帶等[1]。大量研究表明，MSCs具有巨大的治療潛力，因為其具有自我更新和多向分化的潛能，在體內或體外的合適條件下能分化成為多種成體細胞，從而實現組織重建；能夠通過分泌可溶性因子和轉分化等直接或間接刺激進行組織修復[2]。MSCs還具有免疫調節能力，體外擴增的MSCs具有免疫抑制功能，可通過與免疫細胞（如：T和B淋巴細胞、NK細胞及樹突狀細胞等）的相互作用來調節免疫反應，可能成為某些免疫性疾病（如：Crohn's病）的治療手段，對于減少造血干細胞及器官移植后的移植物抗宿主病（ GVHD ）的發生也有一定的作用[3]。另外，MSCs在連續傳代和冷凍復蘇后仍具有上述功能，可作為組織工程和細胞替代治療的種子細胞[4]。

研究表明，圍產期胚外組織中均含有MSCs，包括胎盤的各個部分、胎膜（羊膜和絨毛膜）和臍帶，從臍帶血和羊水中也能分離得到，這種MSCs是一種介于胚胎干細胞（ embryonic stem cells， ESCs ）和成體MSCs之間的干細胞類型，其生長發育關系與ESCs很接近，免疫原性較低，具有廣泛的可塑性，而且比成體MSCs增殖得更快[5]。另外，用于分離細胞的胚外組織在分娩后通常會被丟棄，不會有倫理學方面的問題。臍帶動靜脈之間含有特殊的胚胎粘液樣結締組織 — 沃頓膠（ Whanon's jelly ），由沃頓膠分離得到的間充質干細胞即為人臍帶沃頓膠間充質干細胞（ WJ-MSCs ）。這種來源廣泛、再生能力強、有較強分化潛能、免疫原性低的干細胞，近年來引起人們的極大興趣，特別是其對于再生能力非常有限的心血管組織的恢復與重建，研究者們進行了很多基礎和臨床研究，現將WJ-MSCs的研究進展及其在心血管組織工程中的應用綜述如下：

1 WJ-MSCs的來源

最初，人們從臍帶血、羊水和胎膜獲取細胞，用于圍產期的一些診斷。20世紀80年代，開始應用圍產期干細胞治療白血病和代謝性疾病，1例患者應用HLA匹配的臍帶血（來自患者的兄弟）治療范科尼貧血獲得成功[6]。從此以后，全世界成功實施了超過10 000例臍帶血移植術[7]。20世紀90年代，Langer's和 Vacanti 兄弟提出了再生醫學的概念[8]，之后不久，圍產期胚外組織MSCs便被證明可以應用于組織工程。臍帶是連接胎兒和胎盤的彈性索狀結構，功能是保護其中的血管免受壓迫、扭轉和彎曲，同時也連接著胎兒和母體的血液循環。臍帶包括兩根臍動脈和一根臍靜脈，它們鑲嵌在一種富含蛋白多糖的特殊膠狀基質-沃頓膠中，后者表面覆蓋著羊膜上皮。沃頓膠是一種果凍樣結締組織，主要成分為Ⅰ和Ⅲ型膠原纖維，以及富含粘多糖的膠狀細胞間質。膠原蛋白形成三維網狀結構，與無定形的細胞間質呈松散的連接，細胞間質中則包含數種多聚糖，如：透明質酸等[9]。

早期研究表明，沃頓膠中含有一種成纖維細胞樣、多能間充質干細胞群。這些細胞以前稱為“臍帶基質干細胞”，用來與分離自臍靜脈的內皮細胞（ HUVEC ）和臍帶血間充質干細胞（ UCB-MSCs ）相區別，之后則被稱為“沃頓膠間充質干細胞”（ WJ-MSCs ）[10]。目前，WJ-MSCs可分別源自臍帶的三個區域：即血管周圍區、血管內區和亞羊膜區，各個區域分離得到的細胞在精細結構、免疫組化和體外功能方面的研究結果表明，三者無論是數量還是性質方面均有明顯的差異，由此可推測這些區域的細胞來源可能并不相同。而來自臍帶不同部分的成纖維樣細胞是否來源和性質也不相同，目前仍不清楚。這些細胞表達相似的表面標志，提示其均為MSCs來源[11]。有研究表明，靠近羊膜表面的WJ-MSCs增殖能力更強，而靠近鄰近臍靜脈的WJ-MSCs則有更廣泛的分化潛能[12]。

2 WJ-MSCs的分離和培養

目前，分離WJ-MSCs主要的方法有組織塊培養法和酶消化法[13]。先取15～20cm新鮮臍帶，去除臍靜脈和臍動脈，分離沃頓膠并切碎。組織培養法即是將組織碎塊直接置于培養皿中培養，酶消化法則用蛋白酶（如膠原酶和透明質酸酶）將組織碎塊消化后，用70～100um細胞篩過濾，再重懸于培養基中。酶消化法的優點是得到的細胞比較純，可減少分離沃頓膠時其他細胞（如：紅細胞和內皮細胞等）和組織碎片的污染風險[14]。新鮮分離的WJ-MSCs接種后0～3天處于潛伏期，細胞無明顯增殖，第4天進入對數增長期，10～15天后進入平臺期，此時通常呈成纖維細胞樣。在平臺期，細胞的倍增時間為60～85h，且基本保持穩定，到了生長晚期則呈進行性減少[15]。

3 WJ-MSCs的生物學特性

一方面，WJ-MSCs能滿足成體MSCs定義的最低標準，形態上類似成體MSCs，具有粘附特性，能夠自我更新，并能在體外培養增殖。表形上，WJ-MSCs表達典型的MSCs表面標志，如：CD10、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，同時不表達造血細胞系的表面標志，如：CD34和CD45[16]。在可塑性方面，WJ-MSCs具有多能分化性，能被誘導成為脂肪組織、骨、軟骨、骨骼肌細胞、心肌樣細胞和神經細胞等。另一方面，WJ-MSCs又具有圍產期胚外MSCs的典型特性，與胎盤來源MSCs（ PD-MSCs ）和臍帶血來源MSCs（ UCB-MSCs ）均非常相似。第一，它們均具有多能分化性，且增殖速度快，在體外的增殖潛能比成體MSCs大80倍以上；第二，它們表面表達HLA-Ⅰ分子較成體MSCs低，并且不表達HLA-Ⅱ分子[11]；第三，它們較成體MSCs具有更廣泛的分化潛能，據最新研究表明，WJ-MSCs能夠分化為源自內胚層的組織，如：胰腺和肝臟[17-18]。與臍帶血來源的MSCs相似，WJ-MSCs在體外也能分化為骨和神經細胞[12]。與成體MSCs和PD-MSCs不同， WJ-MSCs持續表達胚胎干細胞的表面標志，如：Oct-4、Sox-2和Nanog，也表達多能性干細胞的表面標志，如：SSeA-4和Tra-1-60。此外，WJ-MSCs在免疫調節方面比成體MSCs具有更廣泛的特性。例如：在混合淋巴細胞試驗中，WJ-MSCs會抑制T細胞的增殖，因此能更好地耐受外源性的移植[3]。綜上所述，WJ-MSCs是一種可靠的、豐富的、廉價來源的多能間充質干細胞，在再生醫學中具有較大的應用潛力。

4 WJ-MSCs在心血管組織工程中的應用

心血管系統的再生能力非常有限，功能性置換是治療心血管損傷和先天缺陷的重要手段，尤其對于新生兒和嬰幼兒更是如此。目前，實施手術是較為普遍的治療手段，然而，手術治療通常使用的置換物為異體的瓣膜或脈管，該類置換物有兩個顯著的缺點：阻塞性組織向內生長和植入物的鈣化，因此每次手術都會有一定的風險。研究者希望能夠在體外培養心血管組織的替代品，以解決這一難題[19]。通常有兩種成體細胞作為種子細胞用于制造心血管組織的替代品，一種為能夠形成細胞外基質的細胞，如：成纖維細胞；另一種為具有抗血栓功能的內皮細胞。在三維支架上先種植成纖維細胞，再種植內皮細胞[20]。與成纖維細胞相比，WJ-MSCs有更好的自我修復能力，更廣泛的可塑性和具有免疫調節能力，而且，它還具有諸多優勢，如：其來源為自體組織、來源豐富、獲得手段對人體幾乎沒有傷害、生長迅速等，因此，WJ-MSCs很有希望代替成纖維細胞成為新的種子細胞用于培育心血管組織替代品。另外，另一種所必需的細胞-內皮細胞也能夠從臍帶靜脈或臍帶血中分離得到。從2002年起[21]，研究者開始探尋WJ-MSCs在心血管組織工程中的可行性，隨后的研究表明，其為一種較好的細胞來源[22]。2006年，Schmidt 等[23]應用異體產前臍帶來源的祖細胞作為細胞源，培育出了具有生物活性的心臟瓣膜小葉。研究者將WJ-MSCs和臍血來源的內皮祖細胞（ EPCs ）種植在生物可降解支架上，在模擬體內生理的環境中培養，并施加化學和（或）物理刺激，最終形成了成熟、分層的小葉組織，其具有與天然組織相似的功能性血管內皮和細胞外基質成分。該研究對于缺乏自體可再生細胞的先天性心臟缺陷的治療具有重要意義。2010年，有研究者率先將微膠囊化技術運用于WJ-MSCs[24]。微膠囊具有諸多優點，如：外表為球型結構，具有更大的表面體積比率；可以設定滲透性，允許參與合成代謝的化合物（如O2、葡萄糖等）進入和細胞的代謝產物（如：CO2、乳酸、激素等）排出，同時不允許免疫球蛋白進入；可以直接注射或通過微創手術植入到多種組織和器官。研究者比較了自由WJ-MSCs和微膠囊化WJ-MSCs在性質和功能方面的差別，結果表明，微膠囊化并不會改變WJ-MSCs的表形，也不影響其生存能力，這就為體內利用WJ-MSCs提供了一種新的可能途徑。最近，Kenar等[25]將WJ-MSCs合并微纖維支架用于修復心肌梗死或減緩心肌組織破環。研究者使用了一種由可生物降解的大空隙管道組成的支架，將WJ-MSCs作為種子細胞種植其上，然后在流動培養液中培養14天，最終的數據顯示，WJ-MSCs的生存能力得到了加強，細胞的同質性和分布均勻程度都有所提高。

5 展望

基于干細胞的再生醫學，為組織器官損傷的治療和重建邁出了革命性的一步，分離和鑒定新的干細胞來源對于再生醫學的臨床應用也至關重要。越來越多的研究表明，源自臍帶的WJ-MSCs是介于胚胎干細胞和成體MSCs的一種干細胞，它結合了兩者的優點，一方面比成體MSCs在體外的擴增效率更高、分化能力更強、免疫原性更低；另一方面又避免了胚胎干細胞在醫學倫理學上的問題，而且來源充足，對于供者沒有創傷和其他臨床風險。這些優勢使得WJ-MSCs在組織工程領域具有巨大的潛力，特別是對于心血管系統這樣再生能力非常有限的組織重建，可以說是最有前途的研究方向之一。目前，將WJ-MSCs用于臨床還存在種種困難，如：移植后在宿主體內難以長期存活、分化為目的細胞的效率較低等，因此，有必要建立分離、鑒定和長期培養WJ-MSCs的臨床相關標準，使其在再生醫學應用中得到更廣泛、更深入的研究。

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[收稿日期]2012-11-10 [修回日期]2013-01-14

編輯/李陽利