Nrf—2—ARE信號通路在胃癌治療研究中的作用及機制

[摘要] Nrf-2-ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是機體最重要的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著雙重作用，一方面可以預(yù)防腫瘤的發(fā)生；另一方面近期的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf-2在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中也起了重要作用。Nrf-2及其下游基因在許多癌前病變及腫瘤組織中表達異常升高，促進了異常增殖的細胞向腫瘤方向分化，腫瘤細胞的生長分裂能力增強，同時Nrf-2的升高能使腫瘤細胞對化療藥物敏感性下降，是腫瘤細胞耐藥機制中的重要一環(huán)。然而，胃癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，它的發(fā)生發(fā)展是一個涉及到分子和細胞改建的多步驟過程。由于受檢測方法及技術(shù)的限制，目前早期胃癌檢出率低，多數(shù)胃癌患者在確診時已達中晚期，因此化學(xué)治療在胃癌患者的綜合性治療中具有重要作用，但是化學(xué)治療在腫瘤中的應(yīng)用卻存在著亟須攻克的問題-多藥耐藥。已有研究表明，Nrf-2在不同期胃癌、癌前病變中存在不同水平的高表達，對胃癌的發(fā)生發(fā)展有一定的促進作用，Nrf-2在細胞核中的堆積是一些腫瘤產(chǎn)生耐藥性的原因。本資料就Nrf-2在胃癌發(fā)展過程中的作用及機制作相關(guān)闡述。

[關(guān)鍵詞] Nrf-2；胃癌；耐藥機制

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）04-32-04

1 Nrf-2-ARE信號通路的結(jié)構(gòu)功能及作用機制

Nrf-2-ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心分子包括核抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）、轉(zhuǎn)錄因子紅細胞系-2p45（NF-E2）相關(guān)因子-2（nuclear fac-tor erythroid-2p45-related factor 2，Nrf-2）和Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associatedprotein 1，Keap1）。核因子E-2-相關(guān)因子2 （NuclearFactor-E2-related factor 2，Nrf-2）屬于轉(zhuǎn)錄因子CNC（cap n collar）亞家族一員，分子量為66 kDa，含有一個高度保守的呈堿性拉鏈狀的亮氨酸結(jié)構(gòu)，能夠與作為珠蛋白基因簇啟動子的NF-E2/APl結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄激活。其中Nrf-2含有的6個結(jié)構(gòu)域均高度保守：Neh l具有能與DNA結(jié)合及參與其他轉(zhuǎn)錄因子的聚合所不可缺少的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。另外，Nehl還含有核定位信號域。Neh 2含有ETGE和DLG兩個模塊，可結(jié)合Kelch域，Keapl正因為含有該結(jié)構(gòu)域而作為Nrf-2的負調(diào)節(jié)因子，還含有七個賴氨酸殘基，這些氨基酸是Nrf-2泛素化降解必需的，與Nrf-2途徑的關(guān)閉與激活密切相關(guān)。Neh3可參與Nrf-2轉(zhuǎn)錄激活，該過程由CHD6輔助因子所介導(dǎo)。Neh4和Neh5是兩個獨立的協(xié)調(diào)作用的反式結(jié)構(gòu)域，兩者均富含酸性氨基酸殘基。Neh6作用目前研究結(jié)果看尚不清楚[1-4]。當細胞微環(huán)境內(nèi)氧化還原處于平衡狀態(tài)時，Nrf-2與其負性蛋白伴侶分子Keap1相結(jié)合存在于細胞質(zhì)而處于被抑制狀態(tài)，Keapl可促進Nrf-2被泛素蛋白酶體降解。Keapl是Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1，含有BTB（broadcomplex，tramtrack，brica-brac）域和Kelch域兩個主要的結(jié)構(gòu)域，主要通過Kelch域與Nrf-2的ETGE域結(jié)合發(fā)揮以上作用，從而使Nrf-2的表達量維持在較低水平。當氧化還原失去原有的平衡，內(nèi)外源有害親電子性代謝物或活性氧增高產(chǎn)生增多的情況下，細胞質(zhì)中的Keap1構(gòu)像和氨基酸會發(fā)生改變，這些改變使得Nrf-2與其解離進入核內(nèi)，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因受ARE序列調(diào)控，進一步激活谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧化蛋白等蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和NAD（P）H-醌還原酶等在內(nèi)的II相解毒酶、多藥耐藥相關(guān)蛋白等的表達，從而扭轉(zhuǎn)氧化還原失衡的狀態(tài)，加速致癌物和抗癌藥物的排除，增強受損蛋白的識別、修復(fù)及清除，加速核苷酸的切除修復(fù)。還可調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子、生長因子的表達，有效抑制細胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5-7]。

2 胃癌發(fā)生發(fā)展中Nrf-2的作用

近年來，Nrf-2-ARE通路與腫瘤發(fā)生以及發(fā)展的存在著重要關(guān)系，這在很多研究中均得到了證實。研究發(fā)現(xiàn)，在高危致癌外環(huán)境中Nrf-2的激活可以保護正常細胞，然而在過氧化環(huán)境及藥物作用下也能夠促進腫瘤細胞的持續(xù)生長。在消化道腫瘤中，Nrf-2在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中有促進作用，已被Ikeda H等的研究所證實。此項研究表明肝癌細胞中Nrf-2存在高表達，并和腫瘤標志物GSTPl均較正常細胞表達高很多，還證實了Nrf-2可與GSTPI啟動子區(qū)域的ARE序列結(jié)合來調(diào)控其表達。而GSTP1被視為一種瘤樣變的標志物，正常組織不表達，在腫瘤組織中高表達[8]。毛景濤等[9]研究了Nrf-2在食管鱗癌組織中的表達及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果顯示Nrf-2在食管鱗癌中高表達，表達的高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及轉(zhuǎn)移度有關(guān)。在原發(fā)性膽囊癌中，楊海明等通過對不同病理類型，不同分級的研究表明Nrf-2的高表達參與了原發(fā)性膽囊的發(fā)生發(fā)展，Nrf-2與原發(fā)性膽囊癌的分化、轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。王洪波通過對Nrf2在正常胃黏膜組織、胃增生性息肉、胃上皮內(nèi)瘤變、胃腺癌的表達研究，表明Nrf-2在病變組織中均有高表達，且隨著惡性程度的增加而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[11]。腫瘤細胞中往往存在著氧化還原環(huán)境的改變，胃癌細胞也不例外。幽門螺旋桿菌（H.Pylori）作為胃癌發(fā)生、發(fā)展中的一大重要因素，在H.Pylori感染后，可促使多形核細胞、單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞發(fā)揮炎性趨化作用而激活，產(chǎn)生氧自由基，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[12-13]。COX-2作為胃癌發(fā)生、發(fā)展、分化、侵襲浸潤的另一大因素，通過產(chǎn)生花生四烯酸，激活細胞膜上的鈣通道致鈣內(nèi)流，增加的鈣離子激活NAD-PH氧化酶，以及和高糖共同作用能夠激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）進而激活PKC依賴的NADP氧化酶等途徑，產(chǎn)生大量活性氧自由基以及通過電羰基衍生物（electrophilic oxo-derivatives，EFOX）分子的硫醇與半胱氨酸、組氨酸等蛋白質(zhì)殘基加合，激活依賴于ARE基因表達的Nrf-2[14-16]。在引起胃癌發(fā)生的很多其他因素諸如外源性物質(zhì)、藥物、重金屬和電離輻射都可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生。在氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的活性氧可以直接對Keap1的半胱氨酸殘基進行修飾引起Keap1的構(gòu)象變化進而導(dǎo)致Nrf-2與Keap1解離，Nrf-2轉(zhuǎn)入細胞核中與ARE結(jié)合，啟動下游多種保護性基因的表達，如抗氧化蛋白類基因、Ⅱ相解毒酶基因、分子伴侶類基因和抗炎因子類基因等，其中抗氧化酶類催化氧自由基轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)和增加其水溶性使自由基排除細胞，從而維持機體的氧化還原平衡[17]。徐華等[18]在萊菔硫烷誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細胞凋亡與胞內(nèi)活性氧的關(guān)系的研究結(jié)果顯示萊菔硫烷對SGC-7901細胞的增生抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，可能是通過誘發(fā)細胞內(nèi)活性氧水平增高，引發(fā)經(jīng)線粒體途徑的內(nèi)源性凋亡而實現(xiàn)的。馬建國[19]研究顯示干擾Nrf-2能增強Hirsutanols A（從南海珊瑚Sarcophyton tortuosum的內(nèi)生菌中分離的一個倍半萜類化合物，能誘導(dǎo)過氧化氫的產(chǎn)生從而殺死腫瘤細胞）能誘導(dǎo)SW480、HepG2產(chǎn)生大量ROS，并殺死腫瘤細胞。蔣崇輝[20]對活性氧生成在8-硝基白楊素誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細胞凋亡中的作用的研究表明：8-硝基白楊素通過誘導(dǎo)活性氧的生成產(chǎn)生誘導(dǎo)癌細胞凋亡的作用。諸如此類的研究表明腫瘤細胞中大量的氧自由基可以促進腫瘤細胞調(diào)亡，殺死腫瘤細胞。基于以上研究，腫瘤細胞中活性氧的增加可以誘導(dǎo)細胞凋亡，而活化的Nrf-2進入細胞核與藥物代謝、清除ROS相關(guān)基因的啟動子結(jié)合，增強其表達，降低細胞內(nèi)ROS水平從而發(fā)揮了其對腫瘤細胞的保護作用，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

3 Nrf2-ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對胃癌耐藥性的作用

近幾年對各類腫瘤的耐藥性的研究中，關(guān)于Nrf2-ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中的作用引起各個研究小組的重視。張凱茹等[21]Nrf-2及其靶基因在人肺腺癌A549順鉑耐藥細胞株中的表達和意義結(jié)果表明，肺腺癌A549細胞株對順鉑的耐藥現(xiàn)象與Keap-1，Nrf-2以及其作用的下游基因的高表達有關(guān)。武正山等[22]在對血紅素氧合酶-1（HO-1）對人胃癌SGC7901細胞5-氟尿嘧啶（5-FU）化療敏感性的影響的研究結(jié)果顯示，HO-1的高表達伴隨著5-FU對胃癌細胞抑制率和凋亡率的下降。血紅素氧合酶-1以及和它同屬于Nrf-2轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的II相解毒酶、抗氧化酶及藥物流出泵的基因在腫瘤耐藥性方面的作用已經(jīng)得到證實。胃癌細胞中存在著Nrf-2的高表達，腫瘤細胞在體內(nèi)各種氧化應(yīng)激條件下，尤其在抗癌藥物作用時會啟動細胞保護機制，這在Kimet SG等[23]的研究中得到了證實，他的研究顯示，當Nrf-2被磷酸化與其胞質(zhì)蛋白伴侶分子Keap-1解離，進入細胞核通過與Maf家族蛋白形成的雜二聚體再與抗氧化劑反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合從而促進Ⅱ相解毒酶中GSTP1基因的激活轉(zhuǎn)錄，上調(diào)GST-π蛋白的表達。荊薇等對胃癌細胞順鉑耐藥性的研究表明，無GST-π蛋白表達的人胃癌MGC-803細胞對順鉑敏感性強于GST-π呈強表達的BGC-823細胞，即下調(diào)GST-π蛋白在人胃癌細胞中的表達，可以增加人胃癌細胞對順鉑的敏感性[24]。此外，在乳腺癌口腔癌及膀胱癌細胞中亦存在著Nrf-2的高表達，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在某些腫瘤細胞Nrf-2的高表達與Keap-1的點突變有關(guān)，因其對Nrf-2的負性調(diào)節(jié)作用消失，最終使Nrf-2調(diào)控的下游基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)相關(guān)產(chǎn)物的表達[25-28]。腫瘤細胞對細胞毒類藥物的解毒作用，產(chǎn)生耐藥性都可能是由GSH和相關(guān)解毒酶的高表達有關(guān)系。基于Nrf-2在腫瘤耐藥性中作用的相關(guān)研究，以及其在胃癌中存在高表達，故推測其在胃癌耐性方面起著重要的作用，但是現(xiàn)在其在胃癌中的研究頗少。

從胃癌耐藥的主要機制來看，生化耐藥起著重要的作用，即腫瘤細胞具有的生化特性和遺傳性在外界物質(zhì)的作用中發(fā)生著復(fù)雜的變化，致使腫瘤細胞通過不同的機制和方式抵抗抗癌藥物對自身的殺傷，這就使得耐藥性的產(chǎn)生，主要包括：（1）使抗癌藥物外排出細胞及使抗癌藥物在細胞內(nèi)重新分布，該機制涉及多藥耐藥基因，多藥耐藥相關(guān)蛋白和P-糖蛋白等。（2）啟動存在于細胞內(nèi)的解毒系統(tǒng)，該作用途徑涉及P450家族、GSH|GST等。（3）通過改變存在于細胞內(nèi)的藥物靶酶的水平或者藥物與內(nèi)酶在細胞中的親和力改變從而促使靶耐藥的產(chǎn)生，主要涉及TopoⅡ、二氫葉酸還原酶等。而細胞內(nèi)的解毒系統(tǒng)通過產(chǎn)生相關(guān)酶以及對抗癌藥物進行生物轉(zhuǎn)化從而解除其對腫瘤細胞的毒性作用，誘導(dǎo)抗癌藥物在腫瘤細胞內(nèi)失活以產(chǎn)生耐藥[24，29-31]。而這些解毒酶在Nrf-2-ARE信號通路異常激活時大量合成，故可以推測胃癌細胞中Nrf-2的表達增加與胃癌耐藥性有必要的聯(lián)系。

4 討論

Nrf-2是近年來抗氧化抗腫瘤蛋白研究熱點之一，當腫瘤細胞中的Keapl或Nrf-2的基因發(fā)生突變，細胞內(nèi)過表達的Nrf-2可以上調(diào)氧化還原平衡蛋白、Ⅱ相解毒酶、轉(zhuǎn)運蛋白的表達，它們通過轉(zhuǎn)化外排有害的活性代謝物及外源性藥物從而保護腫瘤組織，促進腫瘤細胞的生長，抑制凋亡。

在胃癌組織中Nrf-2存在著過表達，影響胃癌發(fā)生發(fā)展的因素從各個層面激活和影響著Nrf-2-ARE信號通路，例如COX-2，與胃癌的發(fā)生和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及臨床分期等密切相關(guān)，但是其誘發(fā)腫瘤的機制尚不明確。各種研究顯示出的COX-2與Nrf-2-ARE信號通路在機體抗炎抗氧化存在著相互作用，在胃癌中兩者的關(guān)系不明確；在抗腫瘤藥物對胃癌的作用的研究結(jié)果顯示，抗腫瘤藥物通過上調(diào)氧自由基的產(chǎn)生促進胃癌細胞的調(diào)亡，而Nrf-2-ARE信號通路的激活卻將氧自由基清除。這些研究基礎(chǔ)為我們進一步研究Nrf-2在胃癌發(fā)生發(fā)展及胃癌耐藥性的作用提供了可能，為研發(fā)Nrf-2特異性抑制劑與化療相結(jié)合提高胃癌對藥物的敏感性提供了可能。Nrf-2有望成為胃癌生物治療中更有效的藥物靶點。

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（收稿日期：2012-11-15）