等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合結(jié)合相對(duì)校正因子測(cè)定丹參中3種成分含量

[摘要] 目的 建立以等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合技術(shù)結(jié)合相對(duì)校正因子計(jì)算方法同時(shí)測(cè)定丹參藥材中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸含量的方法。 方法 等基線三波長(zhǎng)覆蓋融合后以丹酚酸B為內(nèi)標(biāo)成分，建立迷迭香酸、紫草酸與丹酚酸B的相對(duì)校正因子，比較等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合結(jié)合校正因子法與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果之間的差異。 結(jié)果 8批丹參藥材中3個(gè)指標(biāo)性成分，采用等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合結(jié)合相對(duì)校正因子法計(jì)算的含量值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合結(jié)合相對(duì)校正因子法可用于丹參中3種成分含量的同時(shí)測(cè)定，為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的方法。

[關(guān)鍵詞] 丹參；丹酚酸B；迷迭香酸；紫草酸；等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合；相對(duì)校正因子

[中圖分類號(hào)] R284.2；R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）04-100-03

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》名為郄蟬草或卻蟬草，被列為上品，歷代本草均有收載。丹參歸心、肝經(jīng)，藥性微寒，味苦、無(wú)毒，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。丹參在臨床上廣泛用于治療心血管系統(tǒng)疾病，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量、防止心肌缺血和心肌梗塞、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量等作用。而丹參的水溶性酚酸類化合物（丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸等），受到醫(yī)藥學(xué)家的極大重視[2]。本實(shí)驗(yàn)采用新的研究方法組合對(duì)其酚酸類成分進(jìn)行了深入的研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)，Agilent公司），包

括高壓二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器，Agilent 1100色譜工作站；HS6150型超聲波清洗器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；Sartorius CP225D電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Millipore超純水器（美國(guó)，Millipore公司）。

丹參藥材（分別購(gòu)自山東、四川、甘肅、云南、河北、江蘇、安徽等地，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定均為正品）；迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-201001，純度≥98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所），丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-200807，純度≥98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）、紫草酸對(duì)照品（批號(hào)：110326，純度≥98%，四川維克奇生物科技有限公司），乙腈（色譜純，TEDIA公司），甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），冰醋酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心），實(shí)驗(yàn)用水均去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相：A相位1.2%醋酸水，B相乙腈，線性梯度洗脫程序：0 min（5% A）-40 min（41% A）；體積流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃；DAD檢測(cè)器在波長(zhǎng)254、286、330 nm下同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B對(duì)照品一定量置棕色量瓶中，以甲醇為溶劑，配制成單一對(duì)照品溶液，分別吸取各對(duì)照品溶液配制成含迷迭香酸0.18 mg/mL、紫草酸0.16 mg/mL、丹酚酸B 0.51 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取丹參藥材粉末（過(guò)30目篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水25 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min，放冷，再稱重，用水補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，備用。

2.4 等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合后方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、15、20、25、30 μL，在上述色譜條件下分別測(cè)定在330、254、286 nm吸收波長(zhǎng)下的峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。見(jiàn)表1。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取產(chǎn)自山東丹參藥材供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰的峰面積，結(jié)果丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸峰面積的RSD （%）分別為1.10、0.95、0.98。表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取產(chǎn)自山東丹參藥材1 g，精密稱定，共6份，按供試品溶液制備方法操作，置于25 mL容量瓶中。按以上色譜條件分析，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定每份樣品中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸的平均含量（%）分別為4.164、0.369、0.347，RSD（%）分別為1.30、1.48、1.39。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取產(chǎn)自山東藥材供試品溶液，于0，2，4，6，8，12 h分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定各成分峰面積，結(jié)果各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD（%）分別為0.54、0.86、0.72，表明供試品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取丹參（山東）藥材粉末約6份，每份約1 g，精密稱定，分別加入迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B對(duì)照品溶液適量，制備供試品溶液，計(jì)算回收率，結(jié)果迷迭香酸，紫草酸和丹酚酸B的平均回收率（%）是98.4、102.5、100.9，RSD（%）分別為2.05、1.12、1.67。

2.4.6 樣品的含量測(cè)定 取同一丹參（山東）藥材粉末約1 g，精密稱定，制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按以上色譜條件進(jìn)樣分析。測(cè)得丹參藥材中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量見(jiàn)表2。

2.5 等基線三波長(zhǎng)覆蓋融合結(jié)合相對(duì)校正因子法測(cè)定丹參中3成分含量與外標(biāo)法的比較

以丹酚酸B對(duì)照品成分為內(nèi)標(biāo)成分，相對(duì)校正因子fkm=fk/fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）；Wm=（Wk×Am）/（fkm×Ak）；式中Ak為內(nèi)標(biāo)成分對(duì)照品的峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)成分對(duì)照品的濃度，Am為被測(cè)組分的峰面積，Wm為被測(cè)組分的濃度[3]。按以上色譜條件計(jì)算，融合后成分間丹酚酸B與迷迭香酸、紫草酸的相對(duì)校正因子分別為1.79、1.18（n=6）。

分別稱取8個(gè)不同產(chǎn)地丹參藥材粉末（過(guò)30目篩）1 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定。見(jiàn)表2。等基線覆蓋融合結(jié)合相對(duì)校正因子法與外標(biāo)法測(cè)定丹參藥材中3種成分含量，通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，表明這2種方法的測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇

分別對(duì)提取溶劑，提取方式，提取時(shí)間進(jìn)行考察，采用了水回流提取，水超聲處理，提取次數(shù)，超聲時(shí)間考察，結(jié)果表明兩者得到的色譜圖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此采用水超聲處理30 min提取方法提取丹參水溶性成分，方便省時(shí)處理簡(jiǎn)單。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)過(guò)全波長(zhǎng)掃描，結(jié)合3D光譜圖，確定迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B分別在330、254、286 nm下色譜峰信號(hào)最強(qiáng)，而在其他波長(zhǎng)下色譜峰信號(hào)較弱。采用現(xiàn)代分析檢測(cè)手段和計(jì)算機(jī)信息融合方法建立3種成分三波長(zhǎng)等基線融合譜的方法，避免了同一波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品中的幾種成分時(shí)由于某些成分的響應(yīng)值較低或受到信噪比的干擾，使定量結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)。將各成分以其最大吸收波長(zhǎng)融合，在增大信噪比的同時(shí)，縮短了時(shí)間，以確保質(zhì)量檢測(cè)更加穩(wěn)定、可靠。可是對(duì)于信號(hào)較強(qiáng)但無(wú)法獲取對(duì)照品的成分含量難以測(cè)定[4-5]。

3.3 相對(duì)校正因子的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，在中藥各成分間存在著一定的比例關(guān)系，只要各成分的量符合該比例關(guān)系，中藥的多指標(biāo)質(zhì)量控制可以依此法完善。選取其保留時(shí)間與其他成分的分離度較好，價(jià)位低廉而且其穩(wěn)定性較高的待測(cè)成分為內(nèi)標(biāo)成分，以達(dá)到在缺省對(duì)照品或省去昂貴對(duì)照品的前提下準(zhǔn)確的對(duì)其他成分進(jìn)行含量測(cè)定，快速，廉價(jià)的目的[6]。但是對(duì)于響應(yīng)值較低的成分難以準(zhǔn)確定量測(cè)定。

3.4 等基線多波長(zhǎng)覆蓋融合結(jié)合相對(duì)校正因子法優(yōu)點(diǎn)

中藥是個(gè)復(fù)雜的體系，因此應(yīng)該以復(fù)雜性科學(xué)理論和方法加以認(rèn)識(shí)和控制，故本文運(yùn)用此方法建立丹參3種水溶性成分的含量測(cè)定加以說(shuō)明。融合兩個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)屏蔽單應(yīng)用的不足，在增加信噪比，縮短檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省對(duì)照品的同時(shí)保證每個(gè)待測(cè)成分不會(huì)受檢測(cè)波長(zhǎng)及信噪比的影響而減小了檢測(cè)誤差，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量檢測(cè)的全面和整體評(píng)價(jià)。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2012-11-13）