注射用鹽酸吉西他濱無菌方法驗證

[摘要] 目的 對注射用鹽酸吉西他濱的無菌檢查方法進行探討，建立其無菌檢查方法。 方法 按中國藥典2010附錄ⅪH無菌檢查方法進行。 結果 在驗證條件下，該方法能消除對微生物生長的抑制作用。結論 可以采用此法對本品進行無菌檢查。

[關鍵詞] 注射用鹽酸吉西他濱；無菌方法；驗證

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）04-55-02

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）化學名2-脫氧-2，2-鹽酸二氟脫氧胞苷（β-異構體），是一種阿糖胞苷類似物，由美國禮來公司研發的核苷類抗代謝抗癌藥[1]。屬于新型抗嘧啶核苷酸代謝化療藥物，屬細胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細胞，即S期細胞。在一定條件下，可以阻止G1期向S期的進展；具有抗瘤譜廣、作用機制獨特、毒性反應低、與其他化療藥物無交叉耐藥且毒性反應無疊加等特點。在過去的臨床工作中，觀察到鹽酸吉西他濱是療效較好而毒副反應較少的化療藥物之一[2-3]。無菌檢查、細菌內毒素、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目[4]，本品為凍干粉針按照中國藥典2010版附錄ⅠB[5]的要求，要進行細菌內毒素檢查。

1 材料與方法

1.1 儀器

HTY-2000A全封閉集菌儀和NKF集菌培養器（杭州高德泰林有限公司），LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋，SP120水夾套恒溫培養箱，PYX-DHS-50X65-BS隔水式電熱恒溫培養箱，MJX-160B霉菌培養箱。AKL1500凈化工作臺。

1.2 試劑

培養基：硫乙醇酸鹽流體培養基，改良馬丁培養基，營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，0.1%無菌蛋白胨水溶液，0.9%無菌氯化鈉溶液。實驗菌株：白色念珠菌[CMCC（F）98 001]，黑曲霉[CMCC（F）98 003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]，生孢梭菌[CMCC（B）64 941]，大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]以上菌種均為江蘇省康華醫藥科技實業中心。

1.3 方法

1.3.1 樣品供試液的制備 取本品160支，每10支用400 mL的0.1%蛋白胨水溶液復溶，平行制備16瓶，作為供試液。

1.3.2 菌液的制備 稀釋液為0.9%無菌氯化鈉溶液、含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液。

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，培養，按10倍系列稀釋至10-5～10-7。取生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養基培養物與標準比濁管對比，取與比濁管相當的菌液按10倍系列稀釋至10-7。接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，培養，按10倍稀釋至10-5、10-6備用。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，培養5～7 d，加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含孢子數50～100 cfu的孢子懸液。取上述各菌的最后兩級稀釋菌液各1 mL，平行制備2皿，立即傾注瓊脂培養基15～20 mL，營養瓊脂培養基平皿于30～35℃培養24～48 h、玫瑰紅鈉瓊脂培養基平皿于23～28℃培養48～72 h，取生孢梭菌的陽性對照菌液1 mL接入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養基于30～35℃培養18～24 h計數。見表1。

1.3.3 無菌檢查[5]過程

1.3.3.1 培養基的靈敏度檢查 取12 mL/管的硫乙醇酸鹽流體培養基管，分別接種<100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌對照菌液各1 mL，另1支作為空白對照；取9 mL/管的真菌培養基管，分別接種

<100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉對照菌液各1 mL，另1支作為空白對照；硫乙醇酸鹽流體培養基管于培養3 d；白色念珠菌、黑曲霉于培養5 d。在培養的3～5 d內，空白對照管均無菌生長，加菌的各培養基管均生長良好，判該批硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基的靈敏度檢查符合規定

1.3.3.2 培養基的無菌性檢查 取兩種培養基各5瓶，分別置于各自的培養溫度下空白培養14 d。空白培養管均無菌生長，判該批硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基的無菌性檢查符合規定。

1.3.3.3 方法 方法1：取一套二聯培養器用30～50 mL 0.1%蛋白胨水溶液潤濕濾膜。將2瓶供試液全量通過一次性使用的全封閉集菌培養器的二個濾器，然后用0.1%無菌蛋白胨水溶液淋洗濾膜（400 mL/膜，100 mL/次），每次均在振蕩儀上振搖，使可能附著在培養器壁上的抑菌成分沖掉，在兩個濾器中分別加入100 mL的硫乙醇酸鹽流體培養基，其中一個濾器加入10～100 cfu的金黃色葡萄球菌，另一個濾器加入10～100 cfu的枯草芽孢桿菌，作為供試品陽性對照管。另取一套培養器，不加供試品，其它同上操作，作為陽性對照管。另取一套濾器，除供試品外同上操作，其中一管加入100 mL的硫乙醇酸鹽流體培養基，另一管加入100 mL的改良馬丁培養基，作為陰性對照。取供試品與銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同上法操作。其中白色念珠菌、黑曲霉用改良馬丁培養基。方法2：同上操作，沖洗液的用量為600 mL/膜，100 mL/次。

2 結果

觀察、記錄結果分析，見表2、3。

3 討論

采用方法1檢查，供試品陽性對照管（白色念珠菌、黑曲霉）均顯見有微生物生長，且與陽性對照管相近，但供試品陽性對照管（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌）雖見有微生物生長，與陽性對照管比較，生長比較微弱且緩慢，說明在此條件下，供試品對微生物的生長還有一定的抑制作用。

采用方法2檢查，供試品陽性對照管（白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌）

均顯見有微生物生長，與陽性對照管比較，微生物生長明顯，說明在此條件下，供試品對微生物的生長無抑制作用。因此，取驗證方法2作為注射用鹽酸吉西他濱（0.2 g）的無菌檢查方法。

[參考文獻]

[1] 應榮，黃建，郭紅云.鹽酸吉西他濱原料合成工藝研究[J].精細化工中間體，2008，38（5）：34-36.

[2] 李留樹，王如良.非小細胞肺癌的治療進展[J].解放軍保健醫學雜志，2011，3（1）：199-200.

[3] 陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學[M].北京：人民衛生出版社，2004：675-676.

[4] 許玉華，杜鵑，湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005，6（4）：46.

[5] 國家藥典委員會編.中國藥典二部附錄[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：6，103.

（收稿日期：2013-01-04）