乙醇滴注法制備猴頭菇多糖脂質(zhì)體

[摘要] 目的 研究乙醇滴注法制備猴頭菇多糖脂質(zhì)體的最佳處方及制備工藝。 方法 采用乙醇滴注法制備猴頭菇多糖脂質(zhì)體；以包封率和穩(wěn)定性參數(shù)為考察指標，采用正交設(shè)計優(yōu)化處方與制備工藝，紫外分光光度法測定脂質(zhì)體包封率。結(jié)果 最佳處方為磷脂20 mg/mL，膽固醇用量為2.0 mg/mL，VE用量為2.0 mg/mL，藥液濃度為0.8 mg/mL；最佳制備工藝為水浴溫度60℃，滴注速度越小越好，乳勻時間15 min，磁力攪拌速度40 r/min，按最佳處方及工藝制得的猴頭菇多糖脂質(zhì)體均勻圓整，包封率69.7%。 結(jié)論 乙醇滴注法制備工藝簡單，易于掌握，優(yōu)選得到的脂質(zhì)體處方和制備工藝穩(wěn)定可行。

[關(guān)鍵詞] 猴頭菇多糖；脂質(zhì)體；正交試驗；乙醇注入法

[中圖分類號] R944 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）04-51-03

猴頭菌Hericium erinaceus（Bull.Ex Fr.）又名猬菌、刺猬菌、小刺猴頭、猴菇、猴頭菇，隸屬于擔子菌門，齒菌科[1]，是著名的藥食兩用菌。猴頭菇，味甘，性平，歸脾、胃經(jīng)。猴頭菇多糖是猴頭菌的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗突變、防輻射等作用[2]。猴頭菇多糖制成的藥物和保健品深受人們喜愛，開發(fā)前景廣闊。但多糖是一種不太穩(wěn)定的化學物質(zhì)，進入體內(nèi)后，會受到各種胃腸酶的攻擊而降解，失去藥效活性，將其制成脂質(zhì)體制劑后，可以有效地防止胃酸、脂肪酶、胰蛋白酶等對多糖的攻擊；且脂質(zhì)體作為藥物載體可以提高藥物治療指數(shù)，降低藥物毒性[3]。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度儀GBC Cintra10 （澳大利亞GBC公司），高效液相（美國Waters公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司），磁力攪拌器（德國IKA公司），旋渦混合振蕩器（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠），恒溫水浴鍋（北京靖衛(wèi)科學儀器廠）。

猴頭菇多糖（實驗室自制），大豆磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司），膽固醇（sigma公司），VE（sigma公司），95%乙醇、乙醚、三氯甲烷均為分析純。

1.2 猴頭菇多糖脂質(zhì)體制備方法的考察

1.2.1 猴頭菇脂質(zhì)體的制備[4] 采用乙醇滴注法制備猴頭菇多糖脂質(zhì)體。將一定量的磷脂和其他輔料溶于一定量的乙醇溶液中，待完全溶解后滴入60℃下的恒溫藥液中，轉(zhuǎn)速40 r/min，邊滴邊攪拌，滴注速度越小越好，滴注結(jié)束后藥液恒溫攪拌10 min，使之形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體混懸液。室溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，將得到的溶液用蒸餾水定容，于60℃水浴中保溫1 h，冷卻至室溫，用0.45μm的微孔濾膜過濾，灌裝，充氮氣，封口，既得。

1.2.2 含量測定 采用蒽酮-硫酸比色法使用紫外分光光度儀測定猴頭菇多糖含量，檢測波長為（625±1）nm。

1.2.3 包封率（QW）的測定[5] 精密吸取脂質(zhì)體溶液適量，加少許Nacl和氯仿于10 mL容量瓶中；置50℃水浴3 min，拿出放在旋渦混合振蕩器上振蕩2 min，破乳后加蒸餾水至10 mL，搖勻，4℃放置至上層液澄清，測定藥液含量，計算總藥量W1。另取適量脂質(zhì)體溶液，上樣于shodex柱，填料為多孔硅膠，以蒸餾水為洗脫液進行洗脫，流速為1 mL/min；檢測波長為280 nm；通過HPLC的工作站可以得到脂質(zhì)體與游離藥物的分離圖譜直接接取游離藥物量W2。猴頭菇多糖的含量測定用蒽酮-硫酸比色法使用紫外分光光度儀測定。按照公式Qw=（W1-W2）/W1×100%，計算包封率。

1.2.4 穩(wěn)定性參數(shù)（Ke）的測定[6] 精密吸取該脂質(zhì)體溶液0.2 mL，置于10 mL量瓶中，定容至刻度，另取1 mL，置于離心試管中，以5 000 r/min離心5 min，吸取上層溶液0.2 mL于10 mL量瓶中，定容至刻度，分別測定它們在500 nm處的吸光度值D0、D，按下式計算穩(wěn)定性參數(shù)Ke。Ke=（D0-D）/D0，D-代表離心后上層脂質(zhì)體吸光度，D0-代表離心前脂質(zhì)體吸光度。

1.2.5 猴頭菇多糖脂質(zhì)體處方篩選[7] 在單因素考察試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用正交試驗法考察磷脂用量（A）、VE用量（B）、膽固醇用量（C）、藥液濃度（D）4個主要因素及其不同水平對猴頭菇多糖脂質(zhì)體制備的影響，并以Qw和Ke為考察指標篩選最佳處方。本試驗中衡量指標不止一個，因此采用綜合評分法試驗結(jié)果進行分析，對于穩(wěn)定性參數(shù)項用（1-Ke）×100%作其分值，在此分值上再加上包封率指作為綜合分數(shù)。正交試驗因素水平設(shè)計見表1。

1.2.6 制備工藝的優(yōu)化（表3） 在猴頭菇多糖脂質(zhì)體的制備過程中，通過改變制備工藝參數(shù)考察其對猴頭菇多糖包封率和穩(wěn)定性參數(shù)的影響，即水浴溫度設(shè)為50、55、60、65℃4個水平；磷脂液滴注速度為0.5、1.0、1.5、2.0 d/s 4個水平；乳勻時間為8、14、20、26 min 4個水平；磁力攪拌速度分別選擇10、20、30、40 r/min 4個水平。

2 結(jié)果

2.1 猴頭菇多糖脂質(zhì)體制備的處方篩選結(jié)果

在脂質(zhì)體制備的評價指標中，包封率越高、Ke值越小說明該工藝的包合效果越好。在本研究方案所取的因素和水平下以上述兩者的綜合分為評價指標，最后得出最佳生產(chǎn)工藝組合為A3B3C2D2，即磷脂的用量對猴頭菇脂質(zhì)體的包封率和Ke值有較大影響，藥液的濃度和膽固醇濃度次之，VE濃度影響較小。最終確定處方為磷脂20 mg/mL，膽固醇用量為2.0 mg/mL，VE用量為2.0 mg/mL，藥液濃度為0.8 mg/mL。見表2。

2.2 制備工藝優(yōu)化的結(jié)果

通過實驗，最終確定猴頭菇多糖脂質(zhì)體的制備工藝為水浴溫度60℃，滴注速度越小越好，乳勻時間15 min，磁力攪拌速度40 r/min。見表3。

2.3 猴頭菇多糖脂質(zhì)體QW的測定

按照上述實驗得到的最優(yōu)處方及工藝制備3批猴頭菇多糖脂質(zhì)體，并按2.3方法測定其QW得平均值為69.7%。

3 討論

目前，脂質(zhì)體制備方法有注入法、薄膜分散法等[8]。從

藥劑學的角度來考慮，其制備方法應(yīng)具有工藝簡單、包封率高、穩(wěn)定性好、易消毒、適合于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。杏鮑菇多糖極性大是水溶性成分，因此首先考慮用滴注法，該法是獲得脂質(zhì)體的最簡單方法之一。

脂質(zhì)體制備過程中，包封率隨水浴溫度的升高而增大，但當溫度超過60℃時，包封率即下降趨勢，可能是因為此時溫度高于了磷脂的相變溫度，使膜厚度減小導(dǎo)致膜內(nèi)藥物泄露使包封率下降，因此水浴溫度最終選定60℃；當?shù)巫⑺俣冗^快時可以看到藥液中出現(xiàn)明顯的沉淀現(xiàn)象，因此滴注速度越小越好，不能超過1.5 d/s；脂質(zhì)體的粒度及分布受到磷脂濃度的影響，通過加大攪拌速度和延長乳勻時間在一定程度上使其優(yōu)化；然而過度延長乳勻時間QW反而降低，可能由于乳勻時間過長，破壞了部分脂質(zhì)體，導(dǎo)致包封率降低；磁力攪拌速度越快磷脂溶液在水相中分散的越快，包封率也就越高，但攪拌速度太快容易使藥液濺出，所以選擇了40 r/min的攪拌速度使包封率盡量達到最好的效果。多糖是一種不太穩(wěn)定的化學物質(zhì)，進入體內(nèi)后，會受到各種胃腸酶的攻擊而降解，失去藥效活性，脂質(zhì)體不但把治療藥物輸送到靶部位，而且保護了其生物活性[9]。因此將猴頭菇多糖制成脂質(zhì)體具有重要的意義。

[參考文獻]

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（收稿日期：2012-12-11）