溶血磷脂酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響的體外研究

【摘要】目的觀(guān)察溶血磷脂酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha生長(zhǎng)及細(xì)胞形態(tài)的影響。方法①體外培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株Siha，以終濃度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L的溶血磷脂酸和終濃度為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L的多西環(huán)素分別干預(yù)，并設(shè)不加任何藥物作為空白對(duì)照組。各組均干預(yù)72 h后進(jìn)行過(guò)碘酸雪夫反應(yīng) （PAS）染色，用倒置顯微鏡觀(guān)察各組宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及形態(tài)變化。②體外培養(yǎng)Siha細(xì)胞，用終濃度為10 μmol/L的溶血磷脂酸和終濃度為40 mg/L的多西環(huán)素干預(yù)，72 h后固定過(guò)夜，電鏡掃描。結(jié)果①溶血磷脂酸組Siha細(xì)胞隨著溶血磷脂酸濃度升高，癌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞異形性及可塑性增加；多西環(huán)素處理組隨著多西環(huán)素濃度增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞破壞。②電鏡下可見(jiàn)經(jīng)溶血磷脂酸干預(yù)后Siha細(xì)胞表面出現(xiàn)大量分泌顆粒，細(xì)胞變形伸出細(xì)長(zhǎng)突起相互連接。多西環(huán)素組干預(yù)者則細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)輪廓不清晰，細(xì)胞皺縮變形，核碎裂，細(xì)胞溶解。結(jié)論溶血磷脂酸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞株Siha生長(zhǎng)增殖并改變Siha細(xì)胞形態(tài)，而多西環(huán)素則具有相反的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】溶血磷脂酸；宮頸癌；細(xì)胞形態(tài)

文章編號(hào)：1003-1383（2013）03-0323-03中圖分類(lèi)號(hào)：R737.33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤之首。長(zhǎng)期以來(lái)宮頸癌主要的治療手段包括手術(shù)治療和放療，但由于受到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的制約，其治療效果并不理想，總的5年生存率仍徘徊在40%左右[1]。因此尋找新的更有效的化療藥物，解決宮頸癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移問(wèn)題成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)體外試驗(yàn)，觀(guān)察激動(dòng)劑溶血磷脂酸和抑制劑多西環(huán)素對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Siha生長(zhǎng)增殖的影響，為進(jìn)一步研究宮頸癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和尋找藥物作用的新靶點(diǎn)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。材料與方法1.材料人宮頸癌細(xì)胞株Siha購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，溶血磷脂酸購(gòu)自Cayman公司，多西環(huán)素購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。

2.方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)：宮頸癌細(xì)胞株Siha常規(guī)培養(yǎng)于含有10%小牛血清、50 IU/ml青霉素和50 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Siha細(xì)胞，以每孔1×104的密度進(jìn)行細(xì)胞爬片，24 h后棄去培養(yǎng)液。然后溶血磷脂酸組各孔分別加入溶血磷脂酸終濃度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L的培養(yǎng)液，多西環(huán)素組各孔加入多西環(huán)素終濃度分別為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L的培養(yǎng)液，空白組用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液處理。各組繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)進(jìn)行過(guò)碘酸雪夫氏（PAS）染色，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

（2）掃描電鏡：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Siha細(xì)胞，以1×106密度進(jìn)行細(xì)胞爬片，12 h后細(xì)胞貼壁，溶血磷脂酸組加入溶血磷脂酸終濃度為10 μmol/L的培養(yǎng)液、多西環(huán)素組加入多西環(huán)素終濃度為40 mg/L的培養(yǎng)液、空白組用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液處理，72 h后用固定液4℃避光固定過(guò)夜，電鏡掃描。結(jié)果 1.宮頸癌Siha細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)觀(guān)察在倒置顯微鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)空白組細(xì)胞平鋪貼壁生長(zhǎng)，呈梭形，細(xì)胞飽滿(mǎn)，輪廓清晰，細(xì)胞之間排列密集，細(xì)胞間無(wú)接觸抑制，多見(jiàn)分裂相細(xì)胞。經(jīng)溶血磷脂酸干預(yù)后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，胞漿豐富，癌細(xì)胞變?yōu)槎噙呅?，彼此之間呈鑲嵌樣生長(zhǎng)，部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形伸出細(xì)長(zhǎng)突起，明顯可見(jiàn)癌細(xì)胞彼此之間相互連接，細(xì)胞核分裂相增加。隨著溶血磷脂酸濃度的增加，癌細(xì)胞的增殖和形態(tài)的改變逐漸顯著。見(jiàn)封四圖1 a～d。多西環(huán)素組的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞群體數(shù)量

基金項(xiàng)目：廣西衛(wèi)生廳重點(diǎn)科研課題資助[合同號(hào)：重200946]。

作者簡(jiǎn)介：韋紅衛(wèi)（1965-），女（壯族），廣西百色市人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士。Email：how9208@yahoo.com.cn.

顯著稀疏，形態(tài)輪廓變得不清晰，細(xì)胞明顯皺縮變形，細(xì)胞間連接減少，胞體收縮、出泡，有的細(xì)胞拉長(zhǎng)，出現(xiàn)釘狀突起，少見(jiàn)核分裂相，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)向核膜聚集并呈凝塊狀，可見(jiàn)核碎裂，核處于溶解狀態(tài)，并可見(jiàn)到發(fā)泡的凋亡小體。隨著多西環(huán)素濃度增加，癌細(xì)胞的數(shù)量減少和形態(tài)破壞溶解逐漸顯著，濃度達(dá)到40 mg/L時(shí)僅見(jiàn)到少量形態(tài)不完整或溶解破壞的細(xì)胞。見(jiàn)封四圖2a～d。

2.電鏡掃描結(jié)果與空白組相比，溶血磷脂酸組的細(xì)胞變得飽滿(mǎn)，突起明顯，細(xì)胞間連接十分密切，細(xì)胞表面出現(xiàn)大量的分泌顆粒。多西環(huán)素組則出現(xiàn)細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核聚集呈凝塊狀，細(xì)胞處于溶解狀態(tài)。見(jiàn)封四圖3 a～c。討論溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）是具有生長(zhǎng)因子樣作用的脂類(lèi)小分子活性物質(zhì)，是目前已知結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的磷脂，LPA作為一種多功能“磷酸信使”，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)如生長(zhǎng)因子樣作用、趨化作用、刺激血小板聚集及平滑肌收縮、促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及細(xì)胞表面粘連蛋白的結(jié)合等。在生理情況下，LPA在血清中的濃度很低，為1～20 μmol/L，主要由血小板、成纖維母細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分泌，但在應(yīng)激或病理狀態(tài)下其血清濃度顯著升高。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，LPA除了具有以上的生理功能外，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮著重要的作用，如LPA能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)原位增殖；促進(jìn)腫瘤血管生成；提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力；促進(jìn)癌栓的形成[2～4]。孫紅等人報(bào)道LPA在體外能明顯促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，并呈劑量、時(shí)間依賴(lài)關(guān)系[5]。

Siha細(xì)胞是HPV陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞，癌細(xì)胞核仁大且數(shù)目多，核膜和核仁輪廓清楚，電鏡下的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是胞質(zhì)低分化狀態(tài)，含有大量的游離核糖體和部分多聚核糖體，內(nèi)膜系統(tǒng)尤其是高爾基氏器不發(fā)達(dá)，微絲排列不夠規(guī)律；細(xì)胞表面微絨毛增多變粗；細(xì)胞間連接較少。

本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)PAS染色倒置顯微鏡和電鏡掃描觀(guān)察Siha細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng) LPA處理過(guò)的Siha細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞變形，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞連接增加，細(xì)胞核體積增大，核分裂相增多，隨著LPA濃度增加，細(xì)胞增殖及形態(tài)改變逐漸顯著，提示LPA能明顯促進(jìn)Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，增強(qiáng)細(xì)胞間的連接及可塑性。電鏡下還觀(guān)察到經(jīng) LPA處理的Siha細(xì)胞表面有十分豐富的分泌顆粒，說(shuō)明LPA能明顯促進(jìn)Siha細(xì)胞分泌某些物質(zhì)，這些細(xì)胞分泌物可能與癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

多西環(huán)素作為一種抗生素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但最近的研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素還具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，如直接細(xì)胞毒作用或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干擾腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的重塑、抑制多種基質(zhì)金屬蛋白酶的活性和抗血管生成作用等[6]。本研究以多西環(huán)素為對(duì)照組，顯微鏡下觀(guān)察見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量明顯減少、稀疏，細(xì)胞明顯皺縮變形，細(xì)胞核處于溶解狀態(tài)，表明多西環(huán)素能有效抑制宮頸癌Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，提示多西環(huán)素可能具有抑制宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的作用，有可能成為宮頸癌藥物治療的一個(gè)新選擇。

本研究在體外觀(guān)察到了溶血磷脂酸和多西環(huán)素對(duì)Siha細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的影響，這將為宮頸癌的藥物治療提供新的思路，但藥物作用的分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-04-03修回日期：2013-06-04）

（編輯：潘明志英文審校：梁宇）-±s）

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