天門冬組織培養條件的優化

摘要：以天門冬（Asparagus cochinchinensis）幼嫩莖段為外植體，考察1 g/L HgCl2滅菌時間對外植體的消毒效果，以及激素濃度組合對外植體愈傷組織、不定芽的誘導和不定芽生根的影響。結果表明，1 g/L HgCl2處理7 min，外植體褐化率和污染率較低；MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養基中的愈傷組織誘導率最高，且生長勢最強，MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養基中的出芽率最高；1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA培養基中生根率最高，可達76%。

關鍵詞：天門冬（Asparagus cochinchinensis）；莖段；組織培養

中圖分類號：S567.23+9；S339.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4396—03

天門冬（Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.）為百合科天門冬屬的一種[1]，其藥用塊根性寒，味甘、苦，歸肺、腎、胃經，具有養陰潤燥、清肺生津等功能，是珍貴的藥用植物。同時，作為一種重要的切葉植物和園林綠化植物，天門冬有廣泛的種植前景。近年來，隨著天門冬藥材的需求量不斷增大，亂挖濫采導致其野生資源日益枯竭，而天門冬的人工栽培雖然取得了一定的成果，但還未廣泛推廣[2，3]。目前，天門冬的栽培繁殖主要依靠分株繁殖和種子繁殖，分株繁殖增殖系數較低，成活率受諸多因素影響；種子繁殖發芽率低，并且發芽的整齊度不高，出苗所需時間長，種植時難以控制栽植時間，管理費時費工[4]。因此，開展天門冬組織培養技術研究，可解決種苗缺乏問題，有利于快速繁殖大量優質的無毒種苗，為天門冬的人工栽培、工廠化和規模化生產等奠定基礎，具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集廣西藥用植物園種質資源圃中天門冬植株的幼嫩莖段作為天門冬組織培養的外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 HgCl2處理時間對外植體污染率和褐化的影響 取天門冬的幼嫩枝條，用自來水沖洗去掉殘留在枝條上的碎泥等，剪成1.0～2.0 cm長的小莖段，放在加有1%洗潔精的洗滌液中浸泡5～8 min，在自來水下用細流水沖洗20 min。在超凈工作臺上用體積分數75%的乙醇消毒10～40 s，無菌水沖洗3～5次，1 g/L HgCl2分別處理5、7、10 min，再用無菌水沖洗5次，用棉布吸干部分水分后，切去末端部分組織，供接種用。

將經滅菌處理后未變色、無褐化的莖段接入MS+1.5 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT培養基中進行初代培養，接種3周后統計各處理外植體的污染率及褐化情況。

1.2.2 激素組合及濃度對天門冬愈傷組織和不定芽誘導的影響 當初代培養的不定芽長至0.5～1.0 cm高時，將其轉入添加了不同濃度6—BA（0、0.5、1.0 mg/L）、KT（0、0.2、1.0 mg/L）和NAA（0、0.2、1.0 mg/L）的MS培養基中，20 d后統計各處理愈傷組織和不定芽的誘導率及生長情況。將獲得的不定芽在MS+1.0 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT增殖培養基中進行增殖培養。

1.2.3 激素濃度對天門冬不定芽生根誘導的效果 以1/2MS為生根培養基，分別附加不同濃度的NAA（0、0.5、1.0 mg/L）和IBA（0、0.5、1.0 mg/L），進行生根培養。

2 結果與分析

2.1 HgCl2處理時間對外植體污染率和褐化率的影響

天門冬外植體的污染率隨著1 g/L HgCl2處理時間的延長逐漸降低（表1），但褐變率呈上升趨勢。滅菌5 min時，外植體污染率高達87.5%；只有幾個極幼嫩的莖尖未出現污染；滅菌10 min時，滅菌效果最好，污染率大大降低，但同時褐變外植體個數也增多；滅菌7 min時，雖然污染率仍達17.5%，但誘導效果較好，腋芽萌發整齊。因此，天門冬外植體的HgCl2滅菌時間宜為7 min。

2.2 激素濃度組合對天門冬莖段愈傷組織和不定芽誘導的影響

除對照外，添加不同濃度激素的MS培養基均可誘導天門冬莖段產生愈傷組織（表2），愈傷組織誘導率為4%～36%，其中MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養基中的愈傷組織誘導率最高，且生長勢最強。而從不定芽的誘導來看，MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養基中的出芽率最高，達到了92%（圖1）。

2.3 激素濃度組合對天門冬不定芽生根的影響

天門冬不定芽在增殖培養基（MS+1.0 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT）中培養20 d左右，即可獲得4～5倍的增殖系數（圖2）。將高約2～3 cm的天門冬不定芽剪下接種到含不同濃度IBA和NAA的生根培養基中進行生根培養，25 d左右后，不定芽基部皮層形成4～6條粗細不一、長1～3 cm的不定根。從表3可以看出，不添加任何激素的1/2MS培養基不能誘導天門冬芽苗生根，單獨添加IBA或NAA時，生根率均較低，為25%～49%。當0.5 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA配合使用時，對生根有明顯的促進作用，生根率達到76%，且生根速度也加快（圖3）。

2.4 煉苗和移栽

煉苗方式、移栽基質和光照度對試管苗移栽成活率都有很大的影響。苗高約5 cm時開始煉苗，移栽前先把試管苗移出培養室，閉瓶煉苗6 d，再將培養瓶蓋打開，在全天自然光照、溫度25 ℃的通風條件下煉苗3～5 d，移栽時用鑷子或玻璃棒將生根苗從培養瓶中取出，用清水洗干凈根部殘留培養基，移栽入已滅過菌的基質中（菜園土與河沙等體積混勻），移栽后7～10 d內用塑料薄膜保濕，光照強度以遮光率為60%左右最為適宜，保持空氣濕度在85%以上，每天噴霧1次，14 d左右長出新根，每株平均根數為2～5條，30 d后試管苗移栽成活率達82%以上。

3 小結與討論

天門冬作為中成藥、化妝品、飲料及食品等的重要原料被廣泛應用[5—7]，采用組培快繁技術可在短期內獲得大量種苗。而在組培快繁過程中，HgCl2處理時間是影響植株莖段初期誘導的最重要因素之一，從理論上來說，HgCl2處理時間越長，滅菌越徹底，滅菌效果越好，但是滅菌時間過長會破壞外植體的組織結構從而引起褐變，降低外植體的成活率。為了盡量減少外植體褐化并獲得較佳滅菌效果，1 g/L HgCl2處理時間宜為7 min。不添加激素的MS培養基不能誘導愈傷組織的形成，單獨添加6—BA、KT或NAA，愈傷組織誘導率及出芽率均較低，最佳的愈傷組織誘導培養基為MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT；最佳的不定芽誘導培養基為MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。天門冬不定芽的生根以IBA和NAA混合使用效果最好，最佳培養基為1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。

試管苗的移栽成活在組培苗的生產中也非常關鍵，其在培養室內有人工提供的適宜溫度、豐富的養分與充足的水分，因此移栽到自然環境中前需要進行煉苗，以提高存活率。根長為1 cm左右時移栽最佳，根過長容易折斷，影響成活率。

參考文獻：

[1] 汪發瓚，唐 進.中國植物志：第15卷[M].北京：科學出版社，1995.

[2] 歐立軍，王俞人，劉佳蒙，等. 野生天門冬遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 北方園藝，2011（16）：164—166.

[3] 趙 明. 我國天門冬研究的概況及展望[J]. 內江師范學院學報，2006，20（6）：52—55.

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[6] 邢東煒，張閩光. 天冬抗腫瘤作用研究概述[J]. 實用中醫藥雜志，2005，21（4）：253.

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