貴州野生淡黃花百合RAPD反應體系的建立

摘要：以貴州林下野生淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker）幼嫩葉片為材料，采用改良的CTAB法提取百合基因組DNA，得到了較高質量的DNA。并對影響隨機擴增多態DNA性（RAPD）反應的主要因素進行了優化，建立并優化了野生淡黃花百合的RAPD反應體系及程序。優化的20 μL反應體系中包含20 ng模板DNA，2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer 2 μL、0.4 μmol/L隨機引物、ddH2O補足至20 μL。優化的RAPD擴增程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，40個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。該反應體系具有較好的穩定性及可重復性，適合貴州野生淡黃花百合遺傳多樣性研究。

關鍵詞：淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker）；DNA提取；RAPD

中圖分類號：Q523 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4393—03

百合又名夜合、中蓬薯、蒜腦薯、強瞿等，素有“球根花卉之王”的美譽[1]，系百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物[2，3]，其用途廣泛，具有藥用、食用、觀賞價值，是中國衛生部審批通過的首批藥食兩用植物[4]。中國是百合屬植物自然分布的中心，分布有55種及18個變種[5，6]。但目前大部分百合栽培品種非中國育成，開發中國百合野生種質資源，對培育高質量新品種百合具有非常重要的意義[7]。貴州省地理環境復雜多樣，野生百合資源豐富，其中淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker）分布廣泛，是貴州省食品企業制作百合粉的主要原料[8]。為更好地開發利用和保護貴州省的野生百合資源，本實驗以淡黃花百合為材料，探討適合于貴州野生百合的RAPD反應體系，為進一步分析貴州野生百合遺傳多樣性及親緣關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

野生淡黃花百合采自貴州務川縣野生林下，2011年種植于遵義師范學院生物系植物園地內，待萌芽后采集新鮮幼嫩無病蟲害的葉片于封口袋（100 mg/袋），置冰盒中帶回實驗室，—80 ℃超低溫冰箱保存備用。

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 2 000 Marker、瓊脂糖、CTAB等均購自天根生化科技（北京）有限公司；引物（S1027，ACGAGCATGG）購自上海捷瑞生物工程有限公司；氯仿、異戊醇、無水乙醇、EDTA、異丙醇等試劑均為國產分析純。PCR儀、凝膠成像儀均為美國伯樂公司產品，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 淡黃花百合基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法提取淡黃花百合基因組DNA[9]。取200 mg百合葉片，液氮研磨至粉末，置于2 mL離心管中，加入600 μL 65 ℃預熱的2%CTAB提取液，65 ℃水浴30 min，其間每隔10 min輕輕顛倒離心管1次；然后加入等體積的酚—氯仿—異戊醇（體積比25∶24∶1，下同）混合液混勻，12 000 r/min離心10 min；取上清液，用酚—氯仿—異戊醇試劑再抽提1次，12 000 r/min離心10 min，取上清液；加入700 μL預冷的異丙醇，輕輕混勻，12 000 r/min離心10 min，可見白色沉淀；用體積分數75%的乙醇漂洗沉淀，棄上清，在干凈吸水紙上倒置離心管，去除殘留的乙醇，溶于60 μL TE中，4 ℃冰箱過夜溶解，—20 ℃保存。

1.2.2 DNA的檢測 用紫外分光光度計測定百合DNA在260 nm和280 nm波長下的吸光度，依據A260 nm/A280 nm判斷所提取DNA的純度。取5 μL百合DNA樣品進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳（5 V/cm、1 h），在凝膠成像儀上觀察并拍照。

1.2.3 RAPD反應條件優化 隨機選取6個貴州野生淡黃花百合樣本進行擴增。RAPD反應體系為20 μL，設置單因素實驗分別對模板DNA用量（10、20、40、60、80 ng）、Mg2+濃度（1.50、1.75、2.00、2.25、2.55 mmol/L）、dNTPs濃度（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L）、Taq DNA聚合酶用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U）、隨機引物濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L）及RAPD反應程序中的退火溫度（35、36、37、38、39 ℃）、循環次數（25、30、35、40、45）等影響因素進行考察，找出適合于貴州野生淡黃百合RAPD反應的條件。擴增產物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳（5 V/cm、1 h）進行檢測。

2 結果與分析

2.1 野生淡黃花百合基因組DNA的提取結果

以野生貴州淡黃花百合嫩葉片為材料，采用改良的CTAB法提取其基因組DNA，紫外分光光度法檢測結果顯示提取的DNA A260 nm/A280 nm均在1.9左右，DNA濃度在200 ng/μL以上；隨機挑選6個樣本進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1。可以看出，提取的DNA條帶清晰，無拖尾降解現象，其質量和純度均達到了RAPD反應模板的要求。

2.2 RAPD反應條件的優化結果

2.2.1 RAPD反應體系的優化結果 單因素實驗結果表明，野生淡黃花百合RAPD反應體系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及引物濃度均對RAPD反應的效果有較大影響。①模板DNA用量。模板DNA的用量過高或過低均可能導致擴增不成功，20 μL反應體系中，模板DNA用量在10～80 ng時均有擴增產物，但為20 ng時條帶清晰，弱帶能得到較好的顯示，是最適的模板DNA用量。②Mg2+濃度。PCR反應體系中Mg2+濃度過高會導致反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低則會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。本實驗中Mg2+濃度為2.0 mmol/L時擴增效果最好，擴增條帶的明亮度、清晰度和穩定性都較好。③dNTPs濃度。PCR反應體系中，高濃度的dNTPs可加速反應，但同時會增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高反應的精確性，但也會降低反應速度和PCR產物的產量。本實驗中dNTPs濃度為0.25 mmol/L時，擴增產物條帶明亮而清晰。④Taq DNA聚合酶用量。Taq DNA聚合酶是影響PCR反應成功率的關鍵因素，一般來說，隨著Taq DNA聚合酶用量的增加，擴增產物量呈增多趨勢，但Taq DNA聚合酶用量過多，不僅會增加實驗成本，而且會導致非特異性擴增的發生。本研究中Taq DNA聚合酶用量為1.0 U時，擴增產物條帶數量多且較清晰；用量上升到1.5 U時，擴增產物條帶帶型模糊，有彌散背景，給分析帶來困難。⑤引物濃度。PCR反應體系中引物濃度過低，會導致擴增產物產量低，濃度過高則會導致引物二聚體的形成，不利于實驗分析。本實驗中引物濃度為0.4 μmol/L時，擴增產物條帶清晰銳利；濃度為0.2 μmol/L時弱帶消失；大于0.4 μmol/L時引物二聚體的數量增加。

綜上所述，最終確定在20 μL反應體系中含20 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer 2 μL、0.4 μmol/L隨機引物，ddH2O補足至20 μL。

2.2.2 RAPD反應程序的優化結果 退火溫度和循環次數是影響PCR反應能否成功的關鍵因素。在PCR反應程序中，退火溫度要足夠低才能保證引物及目的序列的有效退火，但同時也不能過低，以減少非特異性結合。同樣，PCR循環次數過多將導致非特異性擴增產物的增加，降低PCR反應的特異性；而循環數過少又會使PCR反應產量過低。實驗發現在37 ℃退火40 s時，PCR產物譜帶清晰，特異性最強。而循環次數少于35次時，DNA不能得到充分的擴增，擴增帶少而模糊；循環次數為40次時帶型清晰、穩定；循環次數增加到45次，非特異性條帶增多。因此，優化的RAPD擴增程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性50 s，37 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，40個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

隨機選取6個貴州野生淡黃花百合樣本，按優化的反應體系和反應程序進行RAPD擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖2。可以看出，擴增的6個樣本特異性條帶清晰，并呈現出一定的多樣性，能滿足貴州野生淡黃花百合RAPD遺傳多樣性分析。

3 結論與討論

高質量基因組DNA的提取是RAPD成功的前提[10]，不同植物的基因組提取必須采取與之相適宜的方法。之前的報道常采用百合的入藥部位鱗葉或地上部嫩葉進行基因組DNA的提取。百合鱗葉富含大量的次生代謝產物，提取高質量的基因組DNA難度較大，因此本實驗選擇百合的嫩葉作為材料，并選擇能有效去除嫩葉中糖、酚等雜質的CTAB法，獲得的DNA質量較高，純度及濃度檢測結果表明其能滿足后續實驗的要求。

RAPD反應體系中任何因素的變化都會影響到擴增產物的質量。因此通過單因素實驗對影響RAPD反應的多個因素進行了優化，最終確定適合貴州野生淡黃花百合的RAPD擴增體系（20 μL）為20 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer 2 μL、0.4 μmol/L隨機引物、ddH2O補足至20 μL。擴增程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性50 s，37 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，40個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測發現該條件下的擴增產物條帶清晰，特異性強，為下一步進行貴州野生淡黃百合RAPD遺傳多樣性研究奠定了良好的基礎。

參考文獻：

[1] 黃永芳，楊懋勛，柳 軍，等.廣東野百合DNA提取和RAPD條件的優化[J].熱帶亞熱帶植物學報，2006，14（3）：251—255.

[2] 智 麗，滕中華，李先源，等. 23種野生百合遺傳關系的SRAP分析[J].農業生物技術學報，2011，19（4）：677—684.

[3] 傅立國，陳潭清，郎楷永，等.中國高等植物[M].山東青島：青島出版社，2005.118—133.

[4] 李 黛，張仁波，曾燕玲.務川幾種野生百合的組織培養[J].種子，2011，30（9）：52—55.

[5] 梁松縛.百合科（狹義）植物的分布區對中國植物區系研究的意義[J].植物分類學報，1995，33（1）：25—27.

[6] 張 君，武麗敏，王 雷，等.麝香百合組培快繁技術初步研究[J]. 吉林農業大學學報， 2002，24（1）：53—54.

[7] 張克中，賈月慧，趙祥云，等.部分中國野生百合親緣關系的RAPD分析[J].東北林業大學學報，2006，34（6）：43—45.

[8] 張仁波，李 黛，竇全麗.淡黃花百合花期生物量分配[J]. 安徽農業科學，2011，39（24）：14613—14615.

[9] 趙 琛.亞洲百合DNA的提取及RAPD—PCR反應體系的優化[J]. 中國農學通報，2007，23（2）：89—92.

[10] 范惠玲，孫萬倉，孟亞雄.蕓芥（Eruca sativa Mill.）總DNA提取方法及RAPD擴增體系研究[J]. 西北農業學報，2007，16（1）：17—21.