梨Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列的克隆及分析

摘要：根據Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶的保守區設計簡并引物，從10份梨屬（Pyrus）材料中擴增該逆轉座子片段。擴增產物經純化后克隆于pMD18—T質粒載體，選擇陽性克隆，再經菌落PCR鑒定、測序及序列分析，獲得了14條梨Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列。這些核苷酸序列長度為250～267 bp，具有較高的異質性，主要表現為缺失突變，通過核苷酸聚類可將14條序列分為4個家族。對這些片段的氨基酸序列進行分析，結果顯示有2個序列發生了終止密碼子突變。該研究獲得的梨屬植物Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶氨基酸序列與已報道的其他生物的相應序列有較高的一致性。

關鍵詞：Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶；梨（Pyrus）；克隆；序列分析

中圖分類號：S661.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4388—03

逆轉座子（Retrotransposon）是真核生物中種類最多、分布最廣的轉座因子，也是高等植物核基因組的重要組成部分[1]。各種生物和非生物因子的脅迫都可能誘導逆轉座子發生轉座，導致基因突變、基因組擴增及重排等，造成植物的遺傳變異，從而成為自然選擇的源泉[2—5]，其序列的克隆與分析研究對于植物基因組組成、進化與基因的表達調控研究均有重要的意義。迄今已在蘋果[6，7]、柑橘[8]、柿[9]、葡萄[10]等主要果樹作物中研究分析了逆轉座子的種類和組成。其中Ty1—copia類逆轉座子在植物界廣泛分布，是研究最多的一類[3—5]。目前關于梨逆轉座子的報道較少，該研究依據Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶的保守序列設計簡并引物，采用PCR方法進行梨屬植物Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列的分離克隆，并通過序列分析初步研究其變化特點，以期為梨屬植物的逆轉座子研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究材料包括2個西洋梨（Pyrus communis L.）品種早紅考密斯和康福倫斯，2個砂梨（P. pyrifolia Nakai.）品種豐水和蒲瓜梨，2個白梨（P. bretschneideri Rehd）品種雪花梨和鴨梨，2個秋子梨（P. ussuriensis Maxim）品種安梨和花蓋梨，以及兩個砧木種杜梨（P. betulaefolia Bge.）和豆梨（P. calleryana Dcne.），共10份材料。

1.2 方法

1.2.1 梨基因組DNA的提取及Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶的擴增 取剛展開的嫩葉，采用CTAB法[11]提取基因組DNA，并用紫外分光光度計測定DNA濃度。參照文獻[12]設計Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶的引物，上下游引物序列分別為：5′—ACNGCNTTPyPyTNCAPyGG—3′，5′—APuCATPuTC

PuTCNACPuTA—3′，其中N=A+T+C+G，Py=A+G，Pu=T+C。PCR反應體系為：DNA 20 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.3 μmol/L，2.0 μL 10×Buffer，2.5 mmol/L Mg2+，1 U Taq DNA聚合酶（上海Sunny公司生產），加雙蒸水至20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 120 s；94 ℃ 30 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃ 5 min。反應在Bio—Rad S1000型PCR儀上完成。

1.2.2 PCR產物的回收、克隆及轉化 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并用TaKaRa凝膠回收試劑盒回收早紅考密斯的PCR擴增產物。回收產物經純化后連接于pMD18—T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37 ℃培養16～20 h后藍白斑篩選，挑取白色單克隆，在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜后PCR鑒定陽性克隆。

1.2.3 Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列測定及序列分析 將鑒定為陽性的菌液送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序。利用DNAStar和DNAMAN軟件對獲得的逆轉錄酶序列進行分析。

2 結果與分析

2.1 Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列的PCR擴增結果

采用1%瓊脂糖凝膠電泳對Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列的PCR擴增產物進行檢測，結果如圖1，供試的10份梨屬植物材料均能擴增出長度約為260 bp的Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶片段，與之前的報道一致，說明Ty1—copia類逆轉座子在梨屬植物中普遍存在。

2.2 Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列測定結果

將以早紅考密斯基因組DNA為模板擴增得到的Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列進行回收純化、克隆、測序后，共得到14條序列，全部序列信息已經提交GenBank數據庫，登錄號為JN639033～ JN639046（表1），這些序列與已知植物的Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列有較高的同源性，說明其逆轉座子是真實的。14條序列均富含A、T堿基，其中A、T、C、G堿基的個數分別為55～83、70～99、33～68、44～67，AT與GC比例范圍為1.09～1.69。

2.3 Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶的核苷酸序列和氨基酸序列分析

為了闡明梨Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶間的相互關系，利用DNAStar對分離到的14條逆轉錄酶序列進行聚類分析，構建梨該類逆轉座子的系統發育進化樹（圖2）。根據進化樹Branch的長度把這14條序列分成4個家族，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ家族各包括4個序列，第Ⅲ家族只有2個序列。14條Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶核苷酸序列長度為250～267 bp，短于之前報道的273 bp[4]，說明缺失是造成梨Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列長度變化的主要原因。進一步分析表明，Pcrt3在第25、27、32和59個氨基酸處發生了4個終止密碼子突變；Pcrt14在第10、55、71和89個氨基酸處也存在4個終止密碼子突變（圖3），由此推測終止密碼子突變可能是逆轉座子發生突變及不能表達的主要原因之一。從GenBank中搜索到已登錄的其他生物的Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶的氨基酸序列，與本研究獲得的14條梨Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶的氨基酸序列比對，結果顯示本試驗所克隆到的梨Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶氨基酸序列與蘋果、草莓、柑橘、桃等的有較高的一致性，表明它們可能有共同的起源[13]，也可能是不同物種間逆轉座子橫向傳遞的結果[14]。

3 討論

本研究首次對梨屬植物中的Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶基因進行了PCR擴增，從10份材料中均擴增出長度為260 bp左右的目標片段，說明Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶基因在梨屬植物中廣泛存在。從西洋梨品種早紅考密斯中獲得了14條Ty1—copia類逆轉座子逆轉錄酶序列，這些序列表現出較大的變異性，其核苷酸序列為250～267 bp，存在缺失突變；其中2個序列發生了4個終止密碼子突變，由此推斷缺失突變和終止密碼子突變可能是造成逆轉座子異質性的重要原因。

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