酶解法提取玉米須中總黃酮工藝的優化

摘要：以乙醇溶液為提取劑，采用纖維素酶酶解的方法從玉米（Zea mays）須中提取總黃酮。設計單因素試驗分析了酶用量、酶解溫度、酶解時間、pH、乙醇體積分數和料液比等6個因素對玉米須中總黃酮提取率的影響，采用響應面法進一步優化總黃酮提取的工藝條件。結果表明，酶法提取玉米須中總黃酮的最佳工藝條件為每5.0 g干燥的玉米須粉末中加入3.0 g纖維素酶、酶解溫度45.00 ℃、酶解時間149.1 min、pH 4.49、體積分數30%的乙醇溶液作為提取溶劑、料液比1∶20（m∶V，g/mL），此條件下玉米須總黃酮的提取率可達0.837%。

關鍵詞：玉米（Zea mays）須；總黃酮；纖維素酶；響應面法

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4333—04

玉米須是玉米（Zea mays）干燥的花柱和柱頭，也被稱為玉蜀黍蕊、棒子毛等，是玉米的下腳料。中國的玉米產量居于世界領先地位，每年收獲玉米的同時會產生大量的玉米須。然而目前僅有少量玉米須被用作傳統的中藥材，大部分被白白丟棄。玉米須在環境中長期堆放會滋生大量有害的生物，如霉菌、螨類等。對玉米須進行有效的處理，在實現生物資源有效利用的同時減少環境污染是一個亟待解決的課題。

醫學上認為玉米須具有顯著的利尿、降血糖[1]、抑菌[2]、降壓、增強免疫、抗癌的功效[3]，既有明顯的藥用價值，又具備一定的食療特征[4]。研究人員已經從玉米須中分離鑒定出了黃酮類、苷類、甾類、生物堿、糖類、有機酸、揮發油、微量元素和維生素等多種活性物質[5]。本試驗使用酶解法提取玉米須中的總黃酮，并設計單因素試驗考察了酶用量、提取溫度、提取時間、pH、乙醇溶液體積分數和料液比等因素對黃酮提取率的影響，并在此基礎上采用響應面法對提取工藝進行優化，以最大限度地保持黃酮的穩定性并提高黃酮的得率，為玉米須的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米須為常規型甜玉米花柱頭，購買于華中農業大學校門口的集貿市場。選取質地均勻的玉米須，40 ℃干燥、粉碎，過60目篩，保存在陰涼干燥處。

主要試劑亞硝酸鈉（上海青析化科技有限公司）、硝酸鋁（上海新寶精細化工廠）、氫氧化鈉（天津市風船化學試劑科技有限公司）、鋅粉（湖南湘中化學試劑采供站）、鹽酸（信陽市化學試劑廠）、乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）均為分析純；蘆丁（上海辰云化工有限公司）、纖維素酶（武漢市華順生物技術有限公司）。

主要儀器有分光光度計（725型）、天平（FA1104N），上海精密儀器科學有限公司；恒溫水浴鍋（DF—101s型）、循環水真空泵（SHB—D型），鄭州長城儀器廠；旋轉蒸發儀（Zfa—84型），上海機械專機廠；植物粉碎機，北京醫療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 配制0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液，將其分別稀釋至0.016、0.032、0.048、0.064和0.080 mg/mL，在510 nm處檢測其吸光度，得到蘆丁溶液濃度X（mg/mL）對吸光度A510 nm（Y）的線性回歸方程為Y=9.978X+0.002，相關系數為0.999 4。

1.2.2 單因素試驗 設置單因素試驗分別考察酶用量、酶解溫度、酶解時間、pH、乙醇溶液體積分數和料液比對玉米須總黃酮提取率的影響。①酶用量。取5份干燥玉米須粉末5.0 g，加入體積分數75%的乙醇溶液100 mL，酶的用量分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g（酶活力單位60 U/g），pH 5.0、45 ℃酶解120 min。②酶解溫度。取5份干燥玉米須粉末5.0 g，加入體積分數75%的乙醇溶液100 mL，調節體系pH為5.0，酶用量3.0 g，酶解溫度分別為35、40、45、55、60 ℃，酶解時間120 min。③酶解時間。取5份干燥玉米須5.0 g，加入體積分數75%的乙醇溶液100 mL，調節體系pH為5.0，酶用量3.0 g，酶解溫度45 ℃，酶解時間分別為60、90、120、150、180 min。④pH。取5份干燥玉米須5.0 g，加入體積分數75%的乙醇溶液100 mL，酶用量3.0 g，調節反應體系pH分別為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5，45 ℃酶解150 min。⑤乙醇溶液體積分數。取5份干燥玉米須5.0 g，分別加入100 mL體積分數為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，酶用量為3.0 g，pH 4.5、45 ℃酶解150 min。⑥料液比。取5份干燥玉米須5.0 g，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（m∶V，g/L，下同）加入體積分數30%的乙醇溶液，酶用量為3.0 g，pH 4.5、45 ℃酶解150 min。各單因素試驗酶解反應完成后迅速升溫至90 ℃以上充分滅活10 min，過濾，轉移濾液至250 mL容量瓶定容，測定A510 nm，計算總黃酮提取率。

1.2.3 Box—Benhnken響應面試驗 根據單因素試驗結果以及Box—Benhnken響應面試驗設計原理[6]，在酶用量為原料質量的60%、乙醇溶液體積分數30%、料液比1∶20的條件下設計三因素三水平的響應面試驗，考察酶解溫度、pH和酶解時間對總黃酮提取率的影響，共15個試驗點，其中12個為析因點，3個為零點試驗。Box—Benhnken試驗因素與水平如表1所示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶用量對玉米須總黃酮提取率的影響 玉米須總黃酮的提取率隨酶用量的不同而不同（圖1），其先隨著酶用量的增加而不斷上升，酶用量為3.0 g時達到最大，為0.82%；繼續增加酶的用量，總黃酮的提取率反而下降，可能的原因是酶的用量較低時其可與玉米須底物充分結合，但當底物不能對酶達到飽和的時候，酶的活性會受到抑制。

2.1.2 酶解溫度對玉米須總黃酮提取率的影響 隨著酶解溫度的升高，玉米須總黃酮的提取率先不斷上升，在溫度為45 ℃時達到最高，為0.79%；溫度再上升，總黃酮的提取率反而下降（圖2），可見試驗所用酶的最適反應溫度為45 ℃。

2.1.3 酶解時間對玉米須總黃酮提取率的影響 隨著酶解時間的延長，玉米須總黃酮的提取率先上升，當酶解時間為150 min時提取率達到最大，為0.82%；繼續延長酶解時間，總黃酮的提取率反而下降（圖3），可能的原因是反應時間過長會導致反應體系中已溶出的總黃酮發生降解。

2.1.4 pH對玉米須總黃酮提取率的影響 隨著酶解體系pH的升高，玉米須總黃酮的提取率先不斷上升，當pH為4.5時提取率最高，達0.81%；之后pH再上升，總黃酮的提取率反而下降（圖4），可見試驗所用酶的最適pH為4.5。

2.1.5 乙醇溶液體積分數對玉米須總黃酮提取率的影響 提取劑乙醇溶液的體積分數對玉米須總黃酮提取率有較大的影響。乙醇溶液體積分數過高或過低都會降低總黃酮的提取率（圖5）。用體積分數為30%的乙醇溶液作提取溶劑提取率最高，為0.82%。可能的原因是黃酮是醇溶性的，較高的乙醇溶液體積分數有利于黃酮的溶出，但是乙醇溶液體積分數過高會抑制酶的活性。

2.1.6 料液比對玉米須總黃酮提取率的影響 料液比對玉米須總黃酮提取率的影響結果見圖6。由圖6可知，隨著提取劑乙醇溶液的用量增加，總黃酮的提取率先上升，料液比為1∶20時最大，為0.82%；之后再增加溶劑的用量，提取率反而下降。可能的原因是乙醇溶液用量過少時黃酮和酶不能充分溶于溶劑中；而溶劑用量過大會使反應體系中酶的濃度下降，從而降低了提取率。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析 Box—Benhnken響應面試驗結果見表2。以玉米須總黃酮的提取率為響應值Y，通過SAS軟件的RSREG程序對試驗數據進行響應面分析（RSA），經二次回歸擬合求得響應函數。回歸方程為：Y=—24.505 509 +0.427 190X1+5.438 214X2+0.047 106X3—0.004 312X12—0.010 356X1X2

—0.556 502X22 + 0.000 050 X1X3 + 0.000 195 X2X3—

0.000 169X32，其決定系數R2為0.975 2。從表2可以看出，試驗結果與預測值十分接近。

回歸方程的方差分析結果見表3。模型的F=21.89（P<0.01），二次響應面回歸模型有高度顯著性，二次項達到極顯著水平，可見各試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。由3個因素引起的總黃酮提取率的變異為97.52%，方程擬合很好，可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析，無須進行更高次的擬合。從方差分析結果可以看出各因素對總黃酮提取率的影響大小順序為酶解時間、pH、酶解溫度，且3個因素的影響均達到了極顯著水平。

2.2.2 響應面圖形分析 分別固定X1、X2、X3繪制另2個因素之間的響應面圖和等高線圖（圖7—圖9），結合響應面圖可求解出最佳工藝條件下的特征向量、特征值點坐標及最佳工藝條件下的提取率（表4）。3個因素的特征值均為負，表明此二次響應面有極值存在，可以直接從此二次響應面上找出最佳工藝參數。當特征值X1、X2、X3分別為—0.102 958、—0.142 995、—0.152 632時，臨界點（0.000 493，

—0.013 129，—0.031 092）是最大值點。由臨界點確定最佳工藝條件為：反應溫度45.00 ℃，pH 4.49，酶解時間149.1 min，預測最大提取率為0.836%。在此條件下進行驗證試驗，總黃酮的提取率為0.837%，與理論值沒有顯著差異，可見本試驗優化得到的乙醇酶解法提取玉米須中總黃酮的工藝條件是可靠的。

3 結論

通過單因素和響應面試驗得到優化的酶解法提取玉米須中總黃酮的條件為每5.0 g干燥的玉米須粉末中加入3.0 g纖維素酶、酶解溫度45.00 ℃、酶解時間149.1 min、pH 4.49、溶劑乙醇溶液體積分數為30%、料液比1∶20。此條件下玉米須中總黃酮的提取率可達0.837%。以玉米須為原料提取總黃酮，材料來源廣泛，提取工藝簡單，所得產品穩定性好，具有一定的經濟價值和社會效益。

參考文獻：

[1] 黃曉巍，盧彤宇，歐喜燕，等. 玉米須總黃酮對糖尿病合并心肌缺血大鼠血糖、心電圖及全血黏度的影響[J]. 吉林中醫藥，2009（12）：1074—1075.

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[6] 費榮昌.試驗設計與數據處理[M].無錫：無錫輕工大學出版社，2001.