急性亞極限強度對運動員機體免疫抑制蛋白水平的影響

【摘 要】實驗以急性亞極量強度跑臺運動為主要研究方法，研究急性亞極量強度運動，是否也能夠誘發ISPS的產生，并導致機體免疫機能的變化。研究結論如下：（1）急性亞極量強度運動應激后24小時，受試者血清中sIL-2R值明顯升高；（2）急性亞極量強度運動應激后24小時，ISPS水平升高，對正常小鼠ConA誘導的淋巴細胞增殖產生明顯的抑制作用；（3）急性亞極量強度運動應激后24小時，受試者機體的免疫功能受到抑制。實驗證明了在急性亞極量強度運動應激24小時后，與運動前相比，運動后24小時，sIL-2R表達明顯升高，表明機體內T淋巴細胞處于過度激活狀態。與運動前相比，運動后淋巴細胞的轉化受到明顯的抑制，表明這種亞極量強度的運動可以導致機體內ISPS水平升高；而ISPS和sIL-2R的增加可以使淋巴細胞的功能受到抑制，使運動后機體過度激活的免疫機能得以保護。研究結果為今后在運動實踐中應用ISPS監測運動員免疫機能提供了進一步的理論基礎。

【關鍵詞】急性亞極限強度；運動員；機體免疫抑制蛋白

劇烈的訓練期和緊張的比賽期，運動員免疫機能低下，運動員患感冒、低燒、咽喉腫痛等的發病率增高，這已經成為嚴重削弱運動員體能，影響競技能力的關鍵因素之一。圍繞運動性免疫機能低下，人們已經進行了許多研究[1][2][3][4]，但問題遠未解決。運動后免疫指標出現變化，可以涉及到免疫細胞、免疫球蛋白和免疫細胞因子等眾多方面。

運動應激可使機體血清產生免疫抑制因子ISPS，這是機體對運動應激不適應的反應，可以抑制T、B淋巴細胞轉化，抑制T細胞產生IL-2。矯瑋（1998）[5]在人體上首先發現劇烈運動可以使體內產生免疫抑制因子，由應激產生的免疫抑制因子與機體的抵抗力有密切關系，是機體對運動應激不適應的一種表現，血清中這種抑制因子的產生可作為一個窗口（Window）反映機體抵抗力的變化。免疫抑制因子有可能是競技體育運動員在體力負荷與精神壓力的雙重應激下機體免疫功能降低、抵抗力下降的物質基礎。應激免疫抑制因子很可能是能夠檢測運動員免疫機能低下的理想指標，運動員體內出現免疫抑制因子，正是機體對運動應激不適應的結果，因為用現在的研究手段，在正常人體內檢測不到ISPS。從人體研究來看，目前最短的運動誘導ISPS產生的時間為7天，在急性運動后短時間ISPS是否能在人體內出現，這還需要進一步研究確定，這將為應用ISPS在更大范圍內檢測人體的免疫機能提供實驗依據，也有助于進一步了解ISPS產生的運動條件，本實驗從這方面進行了研究。

1.研究對象與方法

1.1研究對象

河南省某體育學院運動訓練專業研究生8名，男性，所有受試者均無運動訓練史，運動實驗前無感冒、發燒、咽喉腫痛等現象。受試者在實驗前三天禁止進行運動練習。基本情況見表1。

表1 研究對象的基本情況

注：平均數±標準差

1.2研究方法

受試者于試驗前一天，測安靜心率，做跑臺運動一次，運動強度控制在最大儲備心率的（80-85）%，確定適宜的跑速。正式試驗開始，受試者以計算心率運動，出現極度疲勞，不能堅持時，可以休息1次，待心率達120次/分以下時繼續運動，運動情況見表2。

表2 受試者運動情況（N=8）

注：平均數±標準差★：疲勞以自我用力感覺量表R.P.E=17為標準。

受試者于運動前安靜時，運動停止后24小時分別無菌抽取肘靜脈血。血液置4℃6小時凝固后離心（4℃，3000rpm，30min）分離血清[7]，血清于-70℃存待用。

2.指標測試儀器與方法

2.1主要儀器及試劑

CS-15R超速離心機、CO2細胞培養箱 、多頭細胞收集儀 、刀豆蛋白A（ConA）、RPMI1640培養粉、小牛血清、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）、人sIL-2R ELISA試劑盒。

2.2指標檢測方法

2.2.1可溶性白介素-2受體（sIL-2R）

原理：雙抗體夾心ELISA法。

用抗人sIL-2R單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的sIL-2R與單抗結合，加入生物素化的抗人sIL-2R抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的親和素與生物素特異性結合。加入顯色劑，若反應孔中有sIL-2R，將有藍色出現，加終止液變黃。在450nm處測OD值，sIL-2R濃度與OD450值成正比，通過繪制標準曲線求出標本中sIL-2R的濃度。

2.2.2運動員血清對正常小鼠淋巴細胞增殖抑制的作用

取正常BaLB/C雄性小鼠（體重20-22g），頸椎脫位處死，無菌操作下取脾臟，使用完全1640液制成單細胞懸液，使用顯微鏡進行鏡下細胞計數，配制細胞濃度為3×106個/ml。培養液為RPMI1640（GIBCO公司產品）含10%小牛血清，1%青、鏈酶素及谷氨酰胺。誘導淋巴細胞增殖的分裂原為刀豆蛋白A（conA，Sigma公司），濃度為4ug/ml。正式實驗前進行了淋巴細胞增殖標準曲線的繪制，并注意了細胞活性的保持和細胞數的控制。正式實驗時，將運動前、后階段的血清以不同稀釋度（1：16、1：32、1：64）與淋巴細胞和ConA共同加人96孔培養板（總體積為200ul/孔），每種血清的稀釋度均為三復孔，設一組對照，不加血清，僅加入ConA誘導的淋巴細胞和完全1640液各100ul。在含95%空氣及5%CO2的孵育箱中培養42小時，每孔加人20ul的3H-胸腺嘧啶核昔（3H-TdR，北京原子能技術研究所生產），繼續培養6小時后，以多頭細胞收集器將細胞收獲在玻璃纖維濾紙上。用β-液體閃爍儀測定放射活性，以cpm表示。

3.數據處理和統計學檢驗

各指標的測定值以“平均數±標準差”（X±SD）表示。所有統計學處理在SPSS For Windows 11.0統計軟件上完成。用兩兩比較雙尾T檢驗，顯著性水平取P<0.05。

4.研究結果

4.1急性亞極限強度運動后24小時，機體內可溶性白介素2受體的變化

急性亞極限強度運動應激后24小時，受試者血清sIL-2R濃度變化有顯著性差異（P＝0.0003），與運動前相比，運動后明顯升高，結果見表3。

表3 受試者運動前、后血清sIL-2R濃度的變化

運動后與運動前相比，▲▲▲：p＜0.001

4.2急性亞極限強度運動應激后24小時，受試者血清對正常小鼠ConA誘導的淋巴細胞增殖產生抑制作用

急性亞極限強度運動應激后24小時，受試者血清對正常小鼠脾淋巴細胞增殖產生明顯的抑制作用。運動前安靜狀態和運動后24小時分別采血，培養細胞總數為3.0×106個/ml。血清稀釋度分別為1：16、1：32、1：64。運動前、運動后的cpm值見表4。

表4 受試者血清對正常小鼠淋巴細胞增殖的影響

運動后與運動前相比，▲：P＜0.05 ▲▲：P＜0.01

從表4可以看出，整個訓練觀察期內，在1：32稀釋度時，對正常小鼠淋巴細胞增殖影響的CPM值運動前后有顯著性差異（P=0.035），運動后顯著高于運動前。在1：64稀釋度時，對正常小鼠淋巴細胞增殖影響的CPM值運動前后有非常顯著性差異（P=0.005），運動后顯著高于運動前。

5.討論分析

目前運動對免疫系統的影響報道很多，研究發現：運動引起免疫系統的變化隨著運動形式、運動強度、運動持續時間而變化。高強度長時間運動引起免疫系統功能的暫時性抑制[6]；急性短時、中等強度運動激活免疫系統并提高免疫功能[7]；長時間的耐力運動或長期的強化性訓練則抑制免疫功能[8]。

急性運動作為一種應激源，勢必引起機體產生一系列應激反應。但對于急性亞極限強度運動后對機體免疫機能變化的動態過程研究相對較少。急性亞極限強度運動后24小時，機體到底發生了什么樣的變化，這些變化是否影響了機體的免疫功能，直接關系到運動員及教練對訓練計劃的制定和實施，因為這是以天為訓練單位的起點。近年來，體壇競爭激烈，教練員，運動員為取得更好的成績，經常加大運動員訓練強度、訓練量，這些都極易引起運動性免疫抑制的發生，影響運動員正常訓練和比賽。研究采用急性亞極限強度運動方式，在這方面進行了研究。

5.1負荷強度評定指標

在一定的范圍內，心率與負荷強度成正比關系，即強度越大，每分鐘心率越高。研究選擇使用心率指標評定運動強度大小，評定指標選擇亞極限強度心率＝195－年齡[9]。本實驗過程中，受試者年齡狀況為27±3.09，受試者運動情況如表2，可以確定本實驗使用心率評定強度為亞極限。

在實驗的過程中，采用POLAR表監測心率，使用RPE監控受試者的疲勞狀況，提高了實驗的準確性和安全性。

5.2可溶性白介素-2受體（sIL-2R）

sIL-2R是通過T細胞激活，細胞膜表面IL-2R表達增強而釋放出來的。因此，sIL-2R可作為活化T細胞的標記物。sIL-2R是一項較敏感的免疫檢測指標，它既是淋巴細胞活化的標志，又是免疫應答的調節因子。

sIL-2R在免疫調節中的確切功能包括：①作為一種免疫抑制介質能與mIL-2R競爭結合IL-2，作用類似封閉因子。②作為IL-2的轉運蛋白將IL-2運送到遠離其產生部位的組織，增加IL-2在體液中的半衰期。③是mIL-2R的主要廓清方式[10]。崔建軍[11]實驗觀察表明：sIL-2R在體外對淋巴細胞3H-TdR加入量呈劑量依賴性抑制，即隨著含量的增加，對淋巴細胞增殖的抑制活性也同步增加。此與國外學者Chopra的研究結果相似[10]。

運動訓練與sIL-2R的關系也有一定的報道。樊晉華、王安利等（1997）[12]以15名男子自行車運動員為研究對象，實驗全程為23天，先進行5天調整性訓練，大負荷訓練周期為18天，逐步增大訓練負荷。針灸組運動員每日針灸雙側足三里穴30min，共10天。檢測結果表明，在大負荷訓練周期前，針灸組運動員sIL-2R（可溶性白細胞介素2受體）明顯高于非針灸組（P<0.05）。分析認為，運動員連續進行大負荷訓練，可能對有些運動員的免疫機能造成一定程度的不良影響。實驗提示，針灸足三里穴可作為冬訓期間增強和維持自行車運動員免疫機能的輔助手段。但也有研究表明，大強度運動訓練使sIL-2R減少。廉景麗等（2001）[13]研究了長期運動訓練對免疫系統的影響，發現在賽前集訓期內，優秀散手運動員血清IL-2濃度呈逐漸升高趨勢，血清sIL-2R濃度呈逐漸下降趨勢，兩者在整個訓練期內都有顯著性差異。與訓練期前相比，大負荷訓練結束后36小時和賽前一周血清IL-2濃度均顯著升高，sIl-2R濃度顯著下降。整個訓練期內血清IL-2和sIL-2R呈負相關（r＝－0.655，p＜0.05＝。以上的研究均證明，在長時間、大強度運動后，sIL-2R明顯降低，可能對運動員免疫機能造成了不良的影響。本實驗研究發現，急性亞極限強度運動后24小時，與運動前相比，受試者血清sIL-2R濃度明顯升高，且具有顯著性差異。結果提示，與運動前相比，急性亞極限強度跑臺運動后T淋巴細胞處于過度激活狀態，機體的免疫功能處于活躍狀態，運動后T淋巴細胞的活化程度明顯高于運動前。sIL-2R濃度變化可能造成機體免疫機能下降，可能原因：一方面，活化的T淋巴細胞分泌IL-2增加，另一方面，活化的T淋巴細胞膜上mIL-2R表達增加，從膜上脫落的sIL-2R增加并釋放入循環，sIL-2R濃度的升高可中和活化的T淋巴細胞周圍的IL-2，降低IL-2介導的免疫反應，抑制T淋巴細胞過度克隆增殖，使活化的T淋巴細胞靜息下來；同時sIL-2R的增加可以加速mIL-2R的廓清[10]，使IL-2與mIL-2R的結合減少，減少了T細胞的克隆數目，導致機體細胞免疫功能受到抑制。

5.3受試者血清中免疫抑制物質

矯瑋（1998年）[5]以山西省自行車隊8名男性優秀運動員為實驗對象，在冬訓時一個大運動量、大強度的18天訓練期前、后及調整訓練第10天分別3次無菌取血。研究結果表明，持續的大運動量訓練可使運動員血清出現免疫抑制蛋白，其分子量為140KD，在調整訓練第10天ISPS消失；另一實驗表明，一次急性超負荷游泳，即9:00－13:00，14:40－16:10，17:50－18:20，累計游泳6小時，小鼠血清內出現大分子量的免疫抑制因子，其分子量亦為140KD。說明無論長時間大強度，或者急性大強度的實驗過程中，免疫抑制蛋白在運動與免疫的調節中都發揮著作用，矯瑋認為它是不同于神經內分泌調節機制的另一途徑，即免疫抑制蛋白途徑。這是在人體中首次發現這種大分子（分子量大于100KD）的免疫抑制因子，也是運動應激可以產生免疫的抑制因子的首次報道。矯瑋[14]認為免疫抑制因子可能是機體在應激情況下出現的保護性抑制蛋白。

魏宏文（2002年）[15]測定了北京女足在九運會預賽前訓練前、后和預賽后采集的血清對正常小鼠淋巴細胞增殖的影響，研究發現，訓練后運動員的血清對正常小鼠淋巴細胞增殖有明顯的抑制作用，比賽后運動員血清對正常小鼠淋巴細胞增殖的抑制作用下降。

綜上所述，無論在長時間大強度的人體實驗，或者是急性大強度的小鼠游泳實驗過程中，機體內都有同一物質ISPS產生的報道[5，15，16]。多次的研究證實[16，17，18，19]，ISPS對淋巴細胞轉化的增殖抑制作用最明顯，目前用淋巴細胞增殖抑制實驗可間接反映ISPS的相對水平。可見，運動員血清經Sep-pak C18層析處理后，收集流出液。經ZorbaxGF250凝膠過濾柱進行高壓液相層析，收集液按1：16比例稀釋，觀察其對淋巴細胞轉化的影響。結果表明，只有在第18管（9min）時，與大運動量訓練期前相比，大運動量訓練期后運動員血清樣品能顯著抑制正常小鼠淋巴細胞轉化的活性，測定第18管的分子量為140KD。長時間大強度的運動，有很多物質都可能對淋巴細胞轉化產生影響，但作用微小，都不足以產生ISPS這種明顯的作用。

對正常小鼠淋巴細胞轉化的抑制效果

研究以某大學研究生院8名普通健康大學生為研究對象，實驗時完成急性亞極限強度跑臺運動，結果（表4）表明，運動結束24小時后與運動前相比，在血清稀釋度為1：32時，受試者血清對正常小鼠淋巴細胞增殖有一定的抑制作用。在血清稀釋度為1：64時，受試者血清對正常小鼠淋巴細胞增殖有明顯的抑制作用。

實驗結果提示急性亞極限強度運動應激24小時后，機體通過神經、內分泌與免疫系統的相互作用，導致體內ISPS蛋白水平增高，其機制可能為產生該蛋白的T細胞數量的增多，或ISPS在細胞中表達量的增多，或二者兼而有之。淋巴細胞轉化率的明顯下降，可能原因是：一方面ISPS抑制了IL-2的生成，另一方面也可能是由于ISPS封閉了IL-2受體，或者是阻斷了活化信號的傳導途徑，淋巴細胞增殖率明顯下降，從而使機體的免疫功能從激活轉向抑制。

從人體研究來看，文獻上最短的運動誘導ISPS產生的時間為7天，研究的結果證實在急性運動后短至1天（24小時）ISPS就能在人體內被誘導出現。這將為應用ISPS在更大范圍內檢測人體的免疫機能提供實驗依據，也有助于進一步了解ISPS產生的運動條件。

6.結論

實驗發現人體在急性亞極限強度運動結束24小時后，與運動前相比，sIL-2R表達明顯升高，提示機體淋巴細胞功能處于過度激活狀態；與運動前相比，運動后淋巴細胞的增殖受到明顯的抑制，可能是由于亞極限強度運動后24小時機體內ISPS水平升高，結果證實在急性運動后短至1天（24小時）ISPS就能在人體內被誘導出現。主要結論如下：

（1）急性亞極限強度運動應激后24小時，受試者血清sIL-2R值明顯升高。

（2）急性亞極限強度運動應激后24小時，對正常小鼠ConA誘導的淋巴細胞增殖產生明顯的抑制作用，可能是受試者血清中ISPS蛋白水平升高引起。 [科]

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