大別山野生蕙蘭愈傷組織誘導條件的優化

摘要：以大別山地區野生蕙蘭（Cymbidium faberi）的花芽和花莖為外植體進行組織培養，考察了1 g/L HgCl2消毒時間對外植體生長的影響，并通過正交試驗優化誘導愈傷組織的激素濃度組合。結果表明，外植體用1 g/L HgCl2消毒8 min，接種成活率最高；激素濃度組合2 mg/L 2，4-D+4.5 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA培養基最有利于外植體的增重；2 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA有利于誘導花莖和花芽外植體愈傷組織的誘導。

關鍵詞：野生蕙蘭（Cymbidium faberi）；愈傷組織誘導；激素；正交試驗

中圖分類號：S682.31；S339.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5505-03

Optimization of the Callus Induction Conditions of Wild Cymbidium faberi in Dabie Mountain Area

HUANG Jiang，LIAO Si-hong，FANG Yuan-ping，ZHANG Pei，ZHAO Na，XIANG Jun

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization/College of Chemistry and Life Sciences， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： Flower buds and flower stems of Cymbidium faberi were used as explants for callus induction. The effect of 1 g/L HgCl2 disinfecting time on explants was studied. And the combination of plant hormones in medium was optimized by orthogonal design. The results showed that the explants had the highest survive rate when disinfected in 1 g/L HgCl2 for 8 min. The best plant hormone combination for weight increase of explants was 2.0 mg/L 2， 4-D+4.5 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA， for callus induction of both flower buds and flower stems explants was 2.0 mg/L 2， 4-D+4.0 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA.

Key words： wild Cymbidium faberi； callus induction； hormone； orthogonal design

蕙蘭（Cymbidium faberi）為蘭科（Orehidaceae）蘭屬（Cybidum Sw.）多年生草本花卉，具有很高的觀賞價值和經濟價值[1]。近年來由于人們的過度追捧和開采，大量野生蘭花資源被濫挖亂采，遭到嚴重破壞，盡快實現蘭花的人工培育以代替野生資源十分重要[2]。利用生物技術手段對蘭花進行人工培育將對中國蘭花的培養、研究和市場開拓起到重要的作用[3]。目前國蘭的組培快繁技術仍然是制約國蘭產業化的關鍵[4-7]。本研究應用大別山野生蕙蘭花芽和花莖作為組織培養的外植體，采用正交設計篩選出利于蕙蘭愈傷組織誘導和生長的激素濃度組合，為蕙蘭離體快繁和新品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大別山野生蕙蘭是早春開花的蘭花，于秋末分株栽培最佳。于2009年10月在湖北省黃岡市賈廟大崎山挖回少量蕙蘭植株并栽培，秋季為蘭花發芽拔箭期，栽培中要注意保持濕度，施肥宜稀忌濃，以放置1 d的洗米水澆灌為宜，每隔15 d施肥1次。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理 剪下幼嫩的花葶（長度短于8 cm），分離花莖和花芽，在超凈工作臺上用體積分數75%的乙醇消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次，用1 g/L HgCl2對外植體表面進行消毒，處理時間分為4、6、8、10 min。每個處理分別接種30個外植體。用已消毒的吸水紙將材料表面的水吸干。

1.2.2 愈傷組織的誘導 將已消毒的花莖切成長4 mm的小段，每個花芽和花莖再縱切為4塊，接種于愈傷組織誘導培養基，置于25 ℃恒溫培養箱培養，先避光24 h以避免褐化，然后每天光照12 h。采用三因素四水平正交試驗考察2，4-D、6-BA和NAA濃度對愈傷組織誘導率和外植體增重的影響，正交試驗因素與水平見表1。每瓶接種6個外植體，每處理5瓶，觀察并統計污染率、死亡率和成活率，1個月后統計愈傷組織誘導的結果。接種前稱量花莖外植體的質量，待愈傷組織完全形成且外植體的體積不再增大時取出稱重，計算外植體的增重幅度。試驗結果采用SPSS 11.5軟件進行統計分析。

愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的外植體個數/成活的外植體個數×100%

2 結果與分析

2.1 HgCl2消毒時間對接種效率的影響

用1 g/L的HgCl2對花莖和花芽外植體進行消毒處理，消毒時間不同，外植體的污染率、死亡率和成活率有較大差異。表2顯示，對花莖和花芽外植體，污染率均隨消毒時間的延長而降低，而死亡率均隨消毒時間的延長而升高，可見1 g/L的HgCl2消毒時間過短會導致滅菌不充分，而消毒時間過長會造成外植體細胞的損傷，消毒時間為8 min時花莖和花芽外植體的成活率均為最高。

2.2 正交試驗結果

蕙蘭花莖和花芽外植體能夠形成兩種愈傷組織，一類為疏松愈傷組織，多由花芽外植體形成，淡黃綠色，表面凹凸不平，隨著培養時間加長，在固體培養基上逐漸白化死亡（圖1）；另一類為致密愈傷組織，多由花莖外植體形成，深綠色，表面較光滑，肥厚，中間向外拱起，結構致密，較堅硬，分化率高于疏松愈傷組織（圖2）。

正交試驗結果見表3，由極差分析可知對花莖外植體的平均增重幅度影響最大的是2，4-D濃度，其次是NAA濃度，6-BA濃度影響最小；方差分析表明2，4-D對花莖外植體增重幅度的影響達極顯著水平（P<0.01），6-BA和NAA濃度的影響不顯著（P>0.05）。結合正交試驗結果和方差分析結果，花莖外植體增重的最佳試驗組合為A3B4C4，即2 mg/L 2，4-D+4.5 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA。對花莖外植體愈傷組織誘導率影響最大的是6-BA濃度，其次是2，4-D濃度，均達到顯著水平（P<0.05），NAA對花莖外植體愈傷組織誘導率的影響不顯著。花莖外植體愈傷組織誘導的最佳試驗組合為A3B3C4，即2 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA。對花芽外植體愈傷組織誘導率影響最大的是NAA濃度，達到極顯著水平（P<0.01），2，4-D濃度和6-BA對花芽外植體愈傷組織誘導率的影響達顯著水平（P<0.05）。花芽外植體愈傷組織誘導的最佳試驗組合也為A3B3C4。

3 小結與討論

植物生長調節物質對植物組織和細胞的增殖、分化起著關鍵的作用。正交設計是多因素分析的有力工具[8-10]，該方法可以精簡試驗次數，克服在培養基配方設計上的盲目性，大大提高工作效率和試驗的可靠性，目前已經普遍應用于植物組織和細胞培養中。此次研究采用三因素四水平正交設計，在綜合評定的基礎上篩選出了適合誘導蕙蘭花莖愈傷組織誘導的激素配比。

在參試的3種激素中，2，4-D對外植體質量的增加和愈傷組織的誘導率有顯著的影響；6-BA對兩種外植體的愈傷組織誘導率有顯著影響。最有利于促進外植體生長的激素配比為2 mg/L 2，4-D+4.5 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA，最適于花莖和花芽外植體產生愈傷組織的激素配比為2 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA。

目前國蘭的快繁問題依然是制約其產業化發展的關鍵因素[4]，一方面是由于蘭花的無性繁殖容易染菌，不利于優良品質的遺傳，另一方面是由于蘭花的莖為根狀莖或是原球莖，葉片比較硬，芽極小且容易變長成老葉，組織培養的取材非常有限。有學者以新長出來的原球莖為材料，不僅材料少而且極易使受創傷的植株染菌。有學者嘗試以花梗作為蘭花組織培養的外植體，在單莖性蘭花的組培中的應用較多[6]，何子育等[10]曾以蝴蝶蘭花梗為外植體進行組織培養并取得了成功。本研究利用蕙蘭的花芽和花莖作為外植體成功地誘導出了愈傷組織。

愈傷組織的形成是建立無性繁殖體系非常關鍵的一步[11，12]，此次研究中發現，蕙蘭愈傷組織的繼代培養有一定的困難，主要問題是切割以后的愈傷組織容易褐化死亡，是下一步研究需要重點克服的難題，從而在愈傷組織繼代培養的基礎上進一步誘導生根、成苗，以建立蕙蘭完整的無性繁殖體系。

參考文獻：

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（責任編輯 向 闈）