牛大力離體培養與植株再生條件的優化

摘要：分別以野生牛大力（Milletia speciosa）成熟種子、帶芽莖段為材料研究不同激素組合及外植體的離體培養效果。結果表明，1 g/L HgCl2對牛大力種子和帶芽莖段分別消毒10 min和15 min效果最好；愈傷組織和不定芽誘導的最佳激素組合為1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA，種子和帶芽莖段外植體的最高不定芽誘導率分別為95.8%和45.8%；最適合不定芽分化的激素組合為2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA，最高分化率為58.3%；最佳的生根培養基為1/2MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，生根率高達70.8%；最佳移栽基質為等體積混合的黃土、泥炭和河沙，移栽90 d后成活率為73.3%。

關鍵詞：牛大力（Milletia speciosa）；離體培養；種子；帶芽莖段；愈傷組織；移栽

中圖分類號：R282.71；S339.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5499-04

Study on in vitro Culture and Plant Regeneration of Milletia speciosa

WEI Ying，MA Xiao-jun，DONG Qing-song，WEI Kun-hua，LI Cui，BAI Long-hua

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant/Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Conservation and Genetic Improvement，

Nanning 530023， China）

Abstract： Using seeds and stems with buds of wild Milletia speciosa as material， the effects of different hormone combination and explants on the in vitro culture were investigated. The result showed that the optimum treatment time of 1 g/L HgCl2 for seed and stem was 10 and 15 min respectively. The best hormone combination for callus and adventitious buds induction was 1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA， the highest callus induction rate of seeds and adventitious buds of stem with a bud was 95.8% and 45.8%， respectively. The best medium for differentiation of adventitious bud was 2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA； the differentiation rate was 58.3%. And the best rooting medium was 1/2MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA； the rooting rate was 70.8%. The best matrix was mixture of equivalent volume of loess， peat and river sand， the survival rate of 90 days after transplantation reached 73.3%.

Key words： Milletia speciosa； in vitro culture； seed； stem with buds； callus； transplant

牛大力（Radix Millettia Speciosa），又名山蓮藕、金鐘根、倒吊金鐘等，為蝶形花科植物美麗崖豆藤（Milletia speciosa Champ.）的干燥根[1]，是著名的南藥之一，其味甘、性平，歸肺、腎經[2]，在海南、兩廣地區廣泛用作煲湯原料、制作藥膳、藥酒等[3-7]，臨床研究證明其對腰肌勞損、風濕性關節炎、肺結核、慢性支氣管炎等具有一定療效[8]。近年來由于市場需求劇增，牛大力野生資源經過多年采挖，蘊藏量逐漸減少，生產及制藥原料供應日趨緊張，價格不斷攀升[9]。目前牛大力的人工栽培技術尚不成熟，通過組織培養技術進行快速繁殖也還停留在初步研究階段[10-12]。本實驗在前人工作的基礎上，以牛大力種子、帶芽莖段為外植體進行愈傷組織及不定芽的誘導，篩選出最佳的滅菌方法和各個生長階段的最佳激素組合，建立牛大力的無性培養技術，為保護和開發牛大力資源、實現其可持續發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

牛大力種子于2011年5月采自廣西隆安，帶芽莖段于2011年5月采自從海南引種的移栽苗，取材時間為上午9∶30～10∶00。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒 取牛大力成熟種子放入燒杯中，添加2滴洗潔精清洗表面污垢，流水沖洗8～10 min后移至超凈工作臺，體積分數75%的乙醇浸泡40 s，無菌水沖洗1次，再用1 g/L HgCl2消毒6～15 min，無菌水沖洗5次。

選取生長健壯、無病蟲害的植株，剪取幼嫩帶芽莖段作為外植體，剪除葉片后放入燒杯中，加適量自來水及2～3滴洗潔精，輕輕搖動，用棉花輕輕擦洗表面泥土，然后在自來水下沖洗15 min，體積分數75%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗1次，再用1 g/L HgCl2消毒10～20 min，無菌水沖洗5次。

用無菌濾紙吸干種子和莖段外植體表面水分后用消毒好的鑷子夾住，插入培養基中，每瓶接種3個外植體，每個處理接種8瓶。

1.2.2 不同激素組合對牛大力組織培養的影響 基本培養基為MS，含5 mg/L瓊脂、30 mg/L蔗糖，pH 5.8～6.0。將消毒好的牛大力種子、帶芽莖段接種到含0.5 mg/L NAA，6-BA濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L或0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA，IBA濃度分別為0.1、0.3、0.5 mg/L的培養基上進行愈傷組織和不定芽的誘導；取種子、帶芽莖段誘導后所產生的不定芽接種到含0.5 mg/L NAA，6-BA濃度分別為1.5、2.0、2.5 mg/L的固體分化培養基上進行分化培養。將生長健壯、高2～4 cm的不定芽或者芽叢接種到分別以MS和1/2MS為基本培養基，添加不同濃度NAA和IBA的壯苗生根培養基上進行生根培養。培養條件均為培養溫度（25±2）℃、光照時間12 h/d，光照強度20～30 μmol/（m2·s）。30 d后統計出芽率、污染率、分化率、生根率等指標。

2 結果與分析

2.1 不同外植體的滅菌效果

先用體積分數75%的乙醇浸泡種子和帶芽莖段，再用1 g/L HgCl2對2種牛大力外植體材料滅菌，不同處理時間下的滅菌效果見表1。從表1可以看出，用1 g/L HgCl2對牛大力種子進行滅菌后種子均能出芽，而且出芽率較高。消毒時間為10 min時出芽率最高，為91.7%，而且其污染率也最低，為8.3%，所有種子均未產生愈傷組織和出現褐化。而莖段消毒后出芽率相對較低，1 g/L HgCl2消毒時間為15 min時其出芽率最高，為41.7%。此時愈傷組織誘導率也最高，為54.2%；而污染率較低，為4.2%，且褐化率為0。

2.2 不同激素組合對牛大力愈傷組織和不定芽誘導的影響

外植體在添加0.5 mg/L NAA和不同濃度6-BA的培養基中進行培養，誘導率和出芽率結果見表2。在激素組合1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的培養基中，種子培養5 d后開始出芽，芽嫩綠、粗大（圖1），而莖段出芽時間較晚，培養15 d后才開始冒出嫩綠的小芽，且芽相對細弱（圖2），大部分莖段在誘導培養10～20 d后逐漸形成愈傷組織（圖3）。從表2可看出，牛大力的種子和帶芽莖段在含不同濃度激素組合的培養基中的愈傷組織及不定芽誘導率不同，與僅添加6-BA和NAA的處理相比，附加IBA后愈傷組織和不定芽誘導率均得到明顯提高，1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA +0.3 mg/L IBA處理中兩種外植體的不定芽誘導率均為最高，分別為95.8%和45.8%，帶芽莖段的愈傷組織誘導率也高于其他處理。

2.3 不同激素組合對牛大力不定芽分化的影響

在添加不同濃度激素的分化培養基中培養，不定芽的分化情況見表3和圖4、圖5。由表3可以看出，不添加激素的培養基中不定芽分化率均較低，且沒有芽叢生出。添加不同濃度的激素后，不定芽的分化率提高，添加2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA的培養基中分化率最高，達58.3%，但芽叢分化率還是較低，僅為20.8%。

2.4 不同培養基及激素濃度對試管苗生根的影響

將生長健壯、高2～4 cm的不定芽或者芽叢接種到壯苗生根培養基上培養15 d后根開始發生，葉片也逐漸增多，培養30 d后觀察統計生根率和試管苗長勢，結果見表4。從表4可以看出，1/2MS培養基比MS培養基更利于牛大力的生根，生根率升高，試管苗的長勢增強。相比而言，添加適當濃度的NAA和IBA組合比單獨使用NAA生根效果好，生根率較高。最佳壯苗生根培養基為1/2 MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，生根率可達70.8%，植株較為健壯、根粗、根系發達。

2.5 牛大力試管苗的煉苗移栽

試管苗生根培養25～30 d后選擇生長健壯、無污染的試管苗進行煉苗。打開培養瓶的蓋子，并注入少量水淹沒培養基，于室內自然光下煉苗7 d，用鑷子小心取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基（圖6），移栽到不同的基質中。基質以疏松透氣、排水良好、不易發霉為宜。移栽30、60、90 d后分別統計各基質中的成活率見表5。因試管苗一直處于保溫保濕、遮陰的環境下，各處理表現出的成活率均較高，30 d最高成活率能達到93.3%；而60 d和90 d時成活率有較大差別：以單一的泥炭、河沙、黃土為基質的處理中移栽成活率逐漸下降，3種處理間的移栽成活率差異不大，黃土、泥炭和河沙按等體積混合作為基質，90 d時成活率為73.3%，移栽效果相對較好，為最佳的移栽基質組合。同時，移栽后每周需噴施1～2次10倍稀釋的MS大量元素營養液，并及時遮陽，根據需要適當噴施1 g/L的葉面肥等其他肥料，視基質的干濕度噴水。

3 小結與討論

本研究分別采用牛大力種子和帶芽莖段進行不定芽及愈傷組織誘導，發現種子和帶芽莖段都能誘導出芽。相對而言，種子誘導效果較好，不僅誘導率高，而且誘導出的不定芽和試管苗比較粗壯，但種子材料儲藏時間不能超過半年，陳年種子誘導容易污染，很難成功誘導出芽。

帶芽莖段也較易誘導出愈傷組織和不定芽，但一般產生愈傷組織的莖段很難能誘導出不定芽，在培養1個月后觀察，愈傷組織出芽率不超過10%。觀察還發現，莖段離體過程中污染率較高，在試管苗繼代培養時莖段接觸培養基部位容易產生細菌，這可能和牛大力本身的分泌物及表面被有絨毛等有關。此外，莖段誘導產生的愈傷組織和不定芽較易褐化，而實驗中一旦出現褐化或污染就很難再改善苗的質量。本研究采取了無菌苗重復消毒、添加適當濃度頭孢唑林鈉、暗培養等不同方法[11]，在一定程度上降低了褐化和污染率，但并沒取得本質性的改善，還有待進一步研究。

目前關于牛大力離體培養及移栽研究的報道不多[9-12]，本研究在之前報道的基礎上進行了種子與帶芽莖段組織培養及植株再生實驗，并篩選出適宜的激素濃度組合和移栽基質，初步建立了牛大力的無性系，可為進一步探討其離體快繁、提高繁殖系數提供參考。

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（責任編輯 向 闈）